櫻桃谷鴨種公鴨睪丸發育和生殖軸基因表達

陳蓉 雷明明 何宗亮 朱歡喜 戴子淳 應詩家

摘要：?為了揭示櫻桃谷鴨種公鴨的睪丸發育規律，本研究以75日齡、105日齡、135日齡和165日齡櫻桃谷鴨種公鴨為研究對象，首先通過組織學方法觀察睪丸發育和精子發生情況，其次通過Q-PCR方法檢測下丘腦-腦垂體-睪丸軸組織中相關基因表達情況。結果發現，與105日齡相比，135日齡時睪丸質量增加了10倍以上，曲精細管直徑和上皮生精細胞數量增加，腦垂體FSHβ基因mRNA表達量增加了40倍以上。與75日齡相比，105～165日齡腦垂體組織中GnIHR基因mRNA表達量顯著降低。隨著日齡增加，櫻桃谷鴨種公鴨睪丸支持細胞特異性FSHR、INHα、INHβA、AMH基因和間質細胞特異性LHR、StAR、CYP11A1、3β-HSD基因的mRNA表達量顯著增加。以上結果表明，自135日齡開始，在腦垂體FSH和LH刺激下，櫻桃谷鴨種公鴨睪丸進入快速發育階段，支持細胞和間質細胞的分泌功能增強;165日齡時，睪丸能夠產生成熟精子，表明睪丸發育達到性成熟階段。本研究結果為后續櫻桃谷鴨種鴨的繁殖研究提供基礎資料。

關鍵詞：?櫻桃谷鴨;睪丸;生殖軸;基因表達

中圖分類號：?S834??文獻標識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0405-07

Abstract：?In order to understand the testicular development of Cherry Valley breeder ducks， this study took 75， 105， 135， and 165 day-old Cherry Valley breeder ducks as the research objects. Firstly， the testicular development and spermatogenesis were defined through histological methods， and secondly the mRNA expression levels of reproductive axis genes were detected by the method of Q-PCR. The results showed that compared with the 105th day， the testicular weight of Cherry Valley breeder ducks on the 135th day increased by more than 10 times with the increase of the diameter of seminiferous tubules and the number of epithelial spermatogenic cells， and the mRNA expression level of their pituitary FSHβ gene increased by more than 40 times. Compared with the 75th day， the mRNA expression level of pituitary GnIHR gene was significantly reduced on the 105th， 135th， and 165th day respectively. With the increase of days， both the mRNA expression levels of sertoli cell-specific FSHR， INHα， INHβA， AMH genes and Leydig cell-specific LHR， StAR， CYP11A1， 3β-HSD genes were significantly increased in the testicular tissues of Cherry Valley breeder ducks. The above results suggested that the testicular tissues of Cherry Valley breeder ducks had underwent the rapid development since the 135th day under the stimulation of FSH and LH of the pituitary gland， and the secretory function of both Sertoli cells and Leydig cells was enhanced; on the 165th day， the testes could produce mature sperms， indicating that the testicular development had reached sexual maturity. This study provides the basic data for the subsequent research on the reproductive activity of Cherry valley breeder ducks.

Key words：?Cherry valley drake;testis;reproductive axis;gene expression

中國是世界肉鴨養殖和消費大國，2019年肉鴨出欄質量約占全球68%[1]。2019年，中國肉鴨總出欄量約4.43×109只，總產肉量約9.44×106 t，鴨肉總產值達到1.42×1011元。在中國，大量飼養的肉用型鴨品種包括北京鴨、櫻桃谷鴨、麗佳鴨、狄高鴨等。櫻桃谷鴨是以北京鴨為育種材料選育而成的，具有生長速度快、瘦肉率高和飼料轉化率高以及抗病性強等優點。但是，與中國地方蛋用型鴨（如連城白鴨）相比，櫻桃谷鴨（肉用型）種鴨體型大，性成熟時間晚。目前，有關櫻桃谷種鴨的研究主要集中在養殖模式升級和產蛋性能提高方面[2-3]，對于其性成熟啟動和睪丸發育的研究很少。

禽類性腺發育過程受到下丘腦-腦垂體-性腺軸的內分泌調控[4]。在性成熟前某一時間點，下丘腦促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone， GnRH）脈沖釋放增加，引起腦垂體卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone， FSH）和黃體生成素（Luteinizing hormone， LH）的分泌增加，進而刺激性腺發育[5-6]。此外，FSH和LH分泌受到下丘腦促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory hormone， GnIH）的調控[7]。在睪丸組織中，FSH通過特異性受體（FSH receptor， FSHR）作用于支持細胞，促進支持細胞增殖和分化;LH則通過特異性受體（LH receptor， LHR）作用于間質細胞，促進睪酮合成和分泌。睪酮是維持精子產生過程所必需的，主要通過旁分泌方式作用于支持細胞間接調控精子產生[8]。支持細胞能夠分泌多種生長因子，如抑制素A（INHα和INHβA亞基形成的異二聚體）負反饋調控腦垂體FSH分泌[9]，抗繆勒氏管激素（Anti-mullerian hormone， AMH）抑制間質細胞分泌睪酮[10]。為了揭示櫻桃谷鴨種公鴨的睪丸發育規律，本研究擬以不同日齡的櫻桃谷鴨種公鴨為研究對象，首先通過組織學方法觀察睪丸發育和精子產生情況，其次通過實時定量PCR（Real-time quantitative PCR， Q-PCR）方法檢測下丘腦-垂體-睪丸軸組織中基因表達情況。

1?材料與方法

1.1?試驗動物

選取櫻桃谷鴨種鴨（父母代）雛鴨140只（公鴨母鴨各70只），飼養于南京市畜牧家禽科學研究所養殖基地。地面育雛結束后，采用半舍內飼養方式進行混群飼養，舍內設有獨立的飼槽，舍外設有水上運動場。人工定時定量喂料，衛生防疫工作按照種鴨飼養管理基本要求進行，日糧營養標準按照種鴨標準進行配制。

1.2?樣本采集與激素測定

分別隨機選取75日齡、105日齡、135日齡和165日齡公鴨各8只，宰前禁食12 h，稱取活體質量后，翅靜脈采血，靜置30 min后分離血清，-20 ℃保存。經頸部放血致死后，采集左右兩側睪丸組織并稱質量。其中，左側睪丸組織一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蠟切片制作;一部分置于液氮中快速冷凍，用于總RNA提取。同時，采集每個個體的下丘腦和腦垂體組織，置于液氮中快速冷凍，-80 ℃保存。

采用北京北方生物技術研究所有限公司睪酮檢測試劑盒（酶聯免疫法）進行血清睪酮質量濃度測定。

1.3?石蠟切片制作和組織學觀察

睪丸組織經4%多聚甲醛溶液固定24 h后，各日齡公鴨隨機挑選3個樣本，每個樣本切取一小塊組織（0.125 cm3），首先置于乙醇梯度溶液（體積分數為60%、70%、90%和95%乙醇）中進行逐級脫水，然后置于二甲苯溶液中進行透明處理2次，最后置于石蠟中進行透蠟處理，并制備成石蠟塊。石蠟切片（5 μm）固定于載玻片上，進行蘇木精-伊紅染色。染色切片置于光學顯微鏡下拍照并觀察曲精細管直徑以及精原細胞、精母細胞和精細胞數量。

1.4?基因表達分析

采用動物組織總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司產品]提取總RNA，NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA的純度（OD260/280≥1.8;OD260/230≥1.0）和含量。采用PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒[寶日醫生物技術（北京）有限公司產品]以總RNA為模板合成互補cDNA第一鏈。

根據GenBank中綠頭鴨或者近緣物種相關mRNA序列設計基因特異性引物（表1），以β-肌動蛋白（β-actin）為內參基因，按照TransStart Top GreenSuperMix試劑盒（北京全式金生物技術有限公司產品）的說明書配制反應體系并在ABI 7500 Real-Time PCR儀上進行Q-PCR反應，每個樣品重復3次。其中，GnRH-I、GnRHR、GnIH、GnIHR、LHβ、FSHR、INHα、INHβA、LHR基因引物序列引自參考文獻[11]～[14]。

1.5?數據分析

采用2-△△Ct法進行Q-PCR試驗數據處理，目的基因的mRNA表達量采用平均數±標準差的形式表示。采用SPSS軟件進行統計分析，均值比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用LSD法。為了縮小不同日齡數據間存在的差異，對睪丸質量、FSHβ、LHβ、FSHR、AMH、INHα、INHβA、LHR、StAR、CYP11A1、3β-HSD基因mRNA表達量等數據在統計分析前進行對數轉化處理。

2?結果與分析

2.1?不同日齡櫻桃谷鴨種公鴨睪丸發育和血清睪酮濃度變化

隨著日齡增加，櫻桃谷鴨種公鴨的體質量逐漸降低并達到開產前標準體質量（圖1A），其睪丸質量和睪丸指數急劇增加（圖1B、圖1C）。與105日齡相比，135日齡時睪丸質量增加了10倍以上，表明此時睪丸進入快速發育階段。組織學觀察結果表明，隨著日齡增加，睪丸曲精細管直徑和上皮生精細胞數量增加（圖2）。75～105日齡時，睪丸曲精細管上皮由單層變為雙層，主要由支持細胞和精原細胞組成;135日齡時，睪丸曲精細管上皮變為多層，出現了不同發育階段的生精細胞;165日齡時，睪丸曲精細管管腔中出現了成熟精子，表明睪丸發育達到性成熟階段。隨著睪丸發育至成熟，血清睪酮質量濃度顯著增加（圖1D）。

2.2?不同日齡櫻桃谷鴨種公鴨下丘腦和腦垂體組織基因表達變化

隨著日齡增加，櫻桃谷鴨種公鴨下丘腦組織中GnRH-I和GnIH基因mRNA表達量呈現先降低后升高的趨勢，但是不同日齡之間差異不顯著（圖3A、圖3B）。與135日齡相比，165日齡時腦垂體組織中GnRHR基因mRNA表達量顯著降低（圖3C）。與75日齡相比，105～165日齡時腦垂體組織中GnIHR基因mRNA表達量顯著降低（圖3D）。與105日齡相比，135日齡時腦垂體組織中FSHβ基因mRNA表達量增加了40倍以上（圖3E），表明此時睪丸進入快速發育階段。LHβ基因與FSHβ基因的mRNA表達量變化趨勢相一致（圖3F）。

2.3?不同日齡櫻桃谷鴨種公鴨睪丸組織基因表達變化

隨著日齡增加，櫻桃谷鴨種公鴨睪丸支持細胞特異性FSHR、INHα、INHβA、AMH基因的mRNA表達量顯著增加（圖4）。同時，睪丸間質細胞特異性LHR、StAR、CYP11A1、3β-HSD基因的mRNA表達量也顯著增加（圖5）。

3?討論

本研究通過組織學和Q-PCR方法分別檢測了不同日齡櫻桃谷鴨種公鴨睪丸發育和生殖軸相關基因表達情況。結果表明，自135日齡開始，在腦垂體FSH和LH刺激下，櫻桃谷鴨種公鴨睪丸進入快速發育階段，支持細胞和間質細胞的分泌功能增強。165日齡時，睪丸能夠產生成熟精子，表明睪丸發育達到性成熟階段。

禽類性腺發育過程受到下丘腦-腦垂體-性腺軸的內分泌調控。當個體生長發育至某一時間點，下丘腦GnRH脈沖分泌增加，引起腦垂體FSH和LH分泌增加，進而刺激性腺發育。在本研究中，隨著日齡增加，櫻桃谷鴨種公鴨下丘腦GnRH-I和GnIH基因mRNA表達量無顯著變化，但是腦垂體GnIHR基因mRNA表達量顯著降低，表明GnIH活性降低與睪丸發育的啟動有關。潘建秋[15]研究報道，對育成期公雞主動免疫GnIH后，免疫組GnIH活性降低，腦垂體LHβ基因mRNA表達量增加，促進睪丸發育。與105日齡相比，135日齡時腦垂體FSHβ和LHβ基因mRNA表達量顯著增加，推測這是由于GnIH活性降低所導致的。

135日齡開始，在高濃度FSH的刺激下，睪丸支持細胞和精原細胞快速增殖并發生分化，導致曲精細管直徑增加，最終表現為睪丸質量增加。同時，在高濃度LH的刺激下，睪丸間質細胞合成睪酮能力增強，具體表現為LHR、StAR、CYP11A1和3β-HSD等睪酮合成相關基因mRNA表達量顯著增加[16]。165日齡時，睪丸曲精細管中可見成熟精子，表明睪丸發育達到性成熟階段。此時，腦垂體FSHβ基因mRNA表達量顯著降低，這可能是睪丸支持細胞分泌的高濃度抑制素A負調控腦垂體FSH分泌的結果。在哺乳動物中，研究人員發現AMH能夠直接作用于腦垂體調控FSH和LH分泌[17-18]，但在禽類中尚未有相關報道。在本研究中，165日齡櫻桃谷鴨種公鴨睪丸AMH基因高表達是否與腦垂體FSHβ、LHβ基因mRNA表達量下調有關，需要進一步深入研究。

與中國地方蛋用型鴨相比，櫻桃谷鴨（肉用型）種鴨體型大，性成熟時間晚[19]。姚遠等[20]研究報道，連城白鴨90日齡時睪丸曲精細管中可見成熟精子。在本研究中，櫻桃谷鴨種公鴨135日齡時睪丸曲精細管中尚未見成熟精子，比連城白鴨遲45 d以上。基于朱云芬等[21]的研究結果，血清LH濃度的顯著增加與性腺組織的快速發育相一致，本研究推測櫻桃谷鴨種公鴨腦垂體FSH和LH分泌量增加的時間晚于連城白鴨，因此性成熟時間被延遲。

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（責任編輯：陳海霞）