肺離子細胞相關(guān)蛋白ATP6V0D2在不同年齡牦牛肺內(nèi)分布和表達

魏雅婷，崔 燕，張 倩，何俊峰

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

肺離子細胞[1-2](pulmonary ionocyte)是2018年在人和小鼠肺中發(fā)現(xiàn)的一種新型細胞，在肺纖維化的形成機制和修復中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對ATP6V0D2具有獨有的免疫反應(yīng)性[2]。牦牛雖長期處于高原低氧環(huán)境下，但其肺卻無低氧造成的肺纖維化現(xiàn)象[3-4]。現(xiàn)有的肺離子細胞的相關(guān)研究僅限于人和小鼠，尚無其他動物的研究報道，也無ATP6V0D2在低氧環(huán)境中生活動物的研究報道。因此，本研究擬通過免疫組織化學、qPCR和Western blot技術(shù)檢測ATP6V0D2在不同年齡牦牛肺中的分布和表達，確定ATP6V0D2在牦牛肺中的動態(tài)分布和表達情況、探討ATP6V0D2在高原低氧適應(yīng)動物肺結(jié)構(gòu)形成和功能保持方面的可能作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康牦牛肺采自甘南藏族自治州(初生1～7日齡)、青海省西寧市馬家肴屠宰場(幼年1～2歲和老年 7～10歲)、甘肅省臨夏自治州 (成年3～6歲)，每年齡段各3頭。頸動脈放血處死，迅速采集肺組織固定于4%多聚甲醛溶液和液氮中。

1.2 免疫組織化學

石蠟切片4 μm，按SP試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司)說明書處理。ATP6V0D2抗體(Rabbit Anti-ATP6V0D2，bs-12548R，同上)1∶300稀釋，空白對照用0.01 mol·L﹣1的PBS代替一抗，DAB顯色，蘇木精復染。深棕黃色為強陽性表達，淺棕黃色為陽性表達，接近背景色或無色為陰性。Olympus DP71顯微照相系統(tǒng)進行拍攝。

1.3 Western blot

稱0.1 g各年齡組牦牛肺組織，加入1 mL RIPA裂解液和10 μL PMSF，搖床冰浴2.5 h， 4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，吸上清，-20 ℃保存。將提好的蛋白按比例配制，金屬浴變性，進行SDS-PAGE電泳。一抗 (Mouse Anti-ATP6V0D2，ab236375，abcam；Anti-β-actin Mouse，N21123，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，二抗1∶5 000[Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，N21009，同上]。Image J軟件分析目的條帶，根據(jù)所測灰度值計算出蛋白相對表達量，SPSS 19.0軟件進行分析。

1.4 qRT-PCR

NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索牦牛β-actin(NM 173979.3)、ATP6V0D2 (NM 001046101.1)序列，Primer 6軟件設(shè)計引物。目的片段197 bp，引物序列：F: 5′-ACCCCTAGCTCCGTTCTTTC-3′；R: 5′-TGATGATAAAAGCACGCCGG-3′，內(nèi)參片段141 bp，引物序列：F: 5′- GCAATGAGCGGTTCC-3′；R: 5′-CCGTGTTGGCGTAGAG-3′。按照TRIzol試劑(Invitrogen，美國)總RNA提取試劑盒提取4個年齡組牦牛肺組織的總RNA，Promega試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。使用Lightcycler96(Roche，美國)進行qPCR。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學結(jié)果

ATP6V0D2主要分布于肺內(nèi)支氣管及其分支管壁上皮黏膜層的纖毛細胞和克拉拉細胞內(nèi)(圖1)。在各年齡組均呈陽性表達，以成年組和老年組表達強陽性。

a、b.初生組；c、d.幼年組；e、f.成年組；g、h.老年組；i～l.各年齡空白對照。SB.小支氣管；B.細支氣管；TB.終末細支氣管

2.2 實時熒光定量檢測

ATP6V0D2在初生組表達量最高，與其他各組比較，差異性均顯著(P<0.05)；幼年組表達次之，和其他各組比較，差異性均顯著(P<0.05)；成年組和老年組之間表達差異性不顯著(P>0.05)(圖2)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同

2.3 Western blot 檢測

ATP6V0D2在不同年齡組牦牛肺中均能檢測到不同程度的表達(圖3)。成年組表達量顯著高于其他3組(P<0.05)，其他3組兩兩比較，差異性均顯著(P<0.05)(圖3 B)。

A.ATP6V0D2免疫印跡蛋白條帶; B. ATP6V0D2灰度值分析

3 討 論

本試驗結(jié)果顯示，ATP6V0D2在牦牛肺中普遍分布于肺內(nèi)支氣管分支的上皮細胞中，并沒有特定的僅表達于某一種細胞中，這與Plasschaert等[1]僅在肺離子細胞中表達結(jié)論相悖。但也有研究證明，ATP6V0D2會在培養(yǎng)的肺II型細胞[5]、破骨細胞[6]和一些癌細胞[7]中的某個階段表達。Nishi等[8]從小鼠(D2)中分離出編碼亞型D的cDNA，在肺、心和脾中也檢測到表達。ATP6V0D2在牦牛肺內(nèi)細支氣管及其分支上皮黏膜層的纖毛細胞和克拉拉細胞中均有不同程度的分布，可能具有類似肺離子細胞的部分功能，與肺離子細胞可能具有相關(guān)性。本試驗結(jié)果顯示，ATP6V0D2在各年齡組牦牛肺支氣管分支上皮中均有分布，但表達量有所不同，其蛋白以成年組表達量最高。這可能與牦牛肺對低氧環(huán)境的適應(yīng)過程和適應(yīng)能力相關(guān)：初生到幼年階段牦牛肺尚未完全發(fā)育，生理機能尚不健全，處于對低氧環(huán)境的適應(yīng)過程中；成年時肺上皮細胞增生、細胞代謝能力和抗損傷等能力達到頂峰， ATP6V0D2的表達在成年組中達到最大值；之后隨著年齡增長，生理機能下降，ATP6V0D2的表達也開始出現(xiàn)下降的趨勢。ATP6V0D2可能在牦牛肺適應(yīng)高原低氧環(huán)境、防止氣道損傷或修復方面發(fā)揮重要作用，其作用機理仍需進一步研究。

4 結(jié) 論

ATP6V0D2在不同年齡牦牛肺內(nèi)支氣管分支管壁的上皮細胞內(nèi)均有不同程度分布和表達，以成年組表達最高，主要分布于黏膜層的纖毛細胞和克拉拉細胞。牦牛氣道纖毛細胞和克拉拉細胞與肺離子細胞可能具有功能上的相關(guān)性。ATP6V0D2在牦牛肺適應(yīng)高原低氧環(huán)境、防止肺損傷和肺纖維化、肺修復方面可能發(fā)揮重要作用。