1種布魯氏菌微滴式數(shù)字PCR檢測方法的建立

梅 力，王英超，程汝佳，于國際，范學(xué)政，高曉龍，高 敏，秦玉明，李筱英，李巧玲，朱良全*，馮小宇*

(1.北京市動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629； 2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

布魯氏菌病(Brucellosis)，又稱波浪熱，是由布魯氏菌(Brucella)感染所引起的一種細(xì)菌性人獸共患傳染病[1-2]，世界動物衛(wèi)生組織(Office International des Epizooties，OIE)將其列為 B 類動物疫病[1]，豬、牛、羊等普通家畜均易感該病，人主要是通過接觸病畜或食用被布魯氏菌污染的食物而感染。該病主要發(fā)生在內(nèi)蒙古、東北等地的牧區(qū)[3]，近年來，我國布病疫情雖然基本得到控制，但多點(diǎn)散發(fā)的情況依然存在，給畜牧業(yè)和公眾健康造成嚴(yán)重威脅。

目前，針對布魯氏菌的檢測方法很多，其中，細(xì)菌的分離鑒定是布病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該方法主要是以病料的組織、生殖道分泌物、血液等作為可培養(yǎng)物進(jìn)行布魯氏菌的分離鑒定[1,4]，但細(xì)菌分離鑒定操作繁瑣，所需時間較長，且對試驗(yàn)技術(shù)人員的危險較大；PCR、熒光定量PCR等技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于布魯氏菌的檢測，但這些方法的靈敏度還有待提高，特別是在菌含量極低時可能會出現(xiàn)假陰性或可疑結(jié)果，因此有必要建立一種高靈敏度的方法，從而有效提高布魯氏菌檢測的精確度。

微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)目前已被應(yīng)用于病原微生物檢測、腫瘤相關(guān)基因檢測等多個領(lǐng)域[5-6]。ddPCR將一個待分析的PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，每個微滴中含有一個、多個或不含有待檢測的核酸靶分子，數(shù)萬個微滴進(jìn)行獨(dú)立PCR 擴(kuò)增反應(yīng)后，對每個微滴的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，含有熒光信號的微滴判讀為1，不含熒光信號則判讀為0，從而實(shí)現(xiàn)對病原體DNA或RNA的絕對定量[7]。與傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法相比，ddPCR技術(shù)的定量方式不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]，敏感性和準(zhǔn)確性均比傳統(tǒng)方法高[9]。

作者利用微滴式數(shù)字PCR方法的技術(shù)優(yōu)勢，擬建立布魯氏菌微滴式數(shù)字PCR檢測方法，希望為布病的早期診斷、準(zhǔn)確檢測和科學(xué)防控提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 4個種屬共9株布魯氏菌菌株(牛種2株、羊種3株、豬種2株、犬種2株)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9菌株、大腸桿菌O157:H7菌株、沙門氏菌都柏林菌株、沙門氏菌1791菌株、傷寒沙門氏菌及136份牛陰道拭子臨床樣品的核酸均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所專業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 YOSE-S32 天根全自動核酸提取儀，微滴式數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)(QX100Droplet Generator、QX100Droplet Reader、QX100微滴式數(shù)字PCR儀)，ABI-ViiA7 PCR儀。

1.1.3 主要試劑及材料 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技北京有限公司，ddPCRTMSupermix for probes、Droplet generation oil for probe等購自伯樂公司，引物和探針由英濰捷基公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物探針設(shè)計 參考劉志國等[10]發(fā)表的文獻(xiàn)，選取布魯氏菌屬特異性基因BCSP31的保守序列設(shè)計引物和探針，探針5′端標(biāo)記 FAM 熒光報告基團(tuán)，3′端標(biāo)記BHQ1熒光淬滅基團(tuán)。上游引物F：5′-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3′；下游引物R：5′-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3；探針P：FAM-TGCCGTTATAGGCCCAATAGGCAACG-BHQ1。

1.2.2 細(xì)菌核酸提取 按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取布魯氏菌核酸，置-80 ℃?zhèn)溆谩Ｋ芯暝谔崛『怂崆熬?jīng)過了滅活等預(yù)處理，且所有操作均是專業(yè)人員在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.3 微滴式數(shù)字PCR方法建立 主要包括3個步驟。

1.2.3.1 生成微滴：布魯氏菌ddPCR反應(yīng)體系含ddPCR DNA supermix 10 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.9 μL，10 μmol·L-1探針0.5 μL，水 5.7 μL，模板2 μL。參考文獻(xiàn)[11]步驟在微滴生成卡中加入樣品及微滴生成油，于微滴生成儀生成微滴。

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增：取生成的微滴全部轉(zhuǎn)移至96孔 板內(nèi)，參考文獻(xiàn)[11]方法蓋膜、封膜，PCR擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，40個 循環(huán)；52～62 ℃ 1 min；98 ℃ 10 min；4 ℃ 結(jié)束反應(yīng)。

1.2.3.3 讀取微滴：擴(kuò)增完畢后，參考文獻(xiàn)[11]在QX100 Droplet Reader微滴讀取儀上讀取微滴數(shù)據(jù)。

1.2.4 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 優(yōu)化ddPCR反應(yīng)，包括引物、探針濃度及退火溫度。設(shè)置3個引物和探針濃度組：第1組引物濃度500 nmol·L-1、 探針濃度100 nmol·L-1，第2組引物濃度900 nmol·L-1、探針濃度250 nmol·L-1，第3組引物濃度1 200 nmol·L-1、探針濃度350 nmol·L-1； 退火溫度設(shè)置為52、55、58、60、62 ℃。 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如“1.2.3”所示。通過比較ddPCR的微滴生成數(shù)，微滴分布狀態(tài)、微滴熒光信號的強(qiáng)度等來確定優(yōu)化的結(jié)果。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn) 為評估布魯氏菌ddPCR檢測方法的線性關(guān)系、擴(kuò)增效率、靈敏度，將羊種布魯氏菌16M提取核酸后10倍倍比稀釋(10-0～10-6)，進(jìn)行ddPCR檢測，每個濃度重復(fù)檢測3次，以評價方法的靈敏度。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 提取9株不同種屬布魯氏菌菌株(牛種2308、牛種A19、羊種16M、羊種M5、羊種M28、豬種S2、豬種S1330、犬種RM6/66、犬種ZG)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9菌株、大腸桿菌O157:H7菌株、沙門氏菌都柏林菌株、沙門氏菌1791菌株、傷寒沙門氏菌的核酸，使用已經(jīng)優(yōu)化的布魯氏菌ddPCR方法分別對其進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 選取不同濃度的布魯氏菌感染臨床樣品的核酸為模板，使用已經(jīng)優(yōu)化的布魯氏菌ddPCR方法進(jìn)行檢測，每個濃度設(shè)立3個重復(fù)孔，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)，以評價方法的批內(nèi)重復(fù)性；在同樣的反應(yīng)條件下進(jìn)行3次試驗(yàn)，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)，評價該方法的批間重復(fù)性。

1.2.8 臨床樣品檢測 收集136份牛陰道拭子樣品，應(yīng)用細(xì)菌分離培養(yǎng)方法和本研究建立的布魯氏菌ddPCR方法對以上樣品進(jìn)行鑒定和檢測，評價兩種方法的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 布魯氏菌ddPCR方法的建立及優(yōu)化

按照微滴生成、PCR擴(kuò)增和微滴讀取3個步驟建立了布魯氏菌ddPCR方法，并優(yōu)化了引物、探針濃度和退火溫度。

2.1.1 引物和探針濃度優(yōu)化 如“1.2.4”所述，設(shè)置3組引物和探針的濃度進(jìn)行篩選和優(yōu)化，每組濃度檢測3次。結(jié)果顯示，3個組檢測細(xì)菌拷貝數(shù)的平均值分別為1 217、1 452、1 305 copies·μL-1，第2組引物和探針濃度組合檢測的細(xì)菌拷貝數(shù)最多，所以確定最佳的引物和針濃度分別900 nmol·L-1和250 nmol·L-1。

2.1.2 退火溫度優(yōu)化 退火溫度摸索了52、55、58、60、62 ℃，結(jié)果顯示，退火溫度在58 ℃時，拷貝數(shù)最高，因此將退火溫度定為58 ℃。

2.2 ddPCR靈敏度試驗(yàn)

提取羊種布魯氏菌16M的核酸，將核酸從0～1 000 000倍連續(xù)稀釋6個梯度，編號分別為1～7，進(jìn)行ddPCR檢測，每個濃度重復(fù)檢測3次，選取其中5個合適濃度獲得梯度稀釋擴(kuò)增圖(圖1)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。ddPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.991x+5.121 3、R2=0.997 7，線性關(guān)系良好。

A04、A03、A02為100倍稀釋核酸；B04、B03、B02為1 000倍稀釋核酸；C04、C03、C02為10 000倍稀釋核酸；D02、D04、D05為100 000倍稀釋核酸；E01、E02、E05為1 000 000倍稀釋核酸

圖2 ddPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

羊種布魯氏菌16M的核酸梯度稀釋后其拷貝數(shù)檢測結(jié)果如表1，當(dāng)檢測濃度低于10拷貝以下時該方法也能穩(wěn)定檢出，且CV值為6.84%，故取其平均值1.12 copies·μL-1確定為該方法的最低檢測下限。

表1 倍比稀釋檢測結(jié)果

2.3 ddPCR特異性試驗(yàn)

用本次所建立的布魯氏菌數(shù)字PCR方法分別檢測9株不同種屬的布魯氏菌菌株、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9菌株、大腸桿菌O157:H7菌株、沙門氏菌都柏林菌株、沙門氏菌1791菌株、傷寒沙門氏菌，結(jié)果如圖3、4所示，9株不同種屬的布魯氏菌菌株均能被檢測到，而其他5種細(xì)菌均不能被檢測到，說明本方法的特異性較好。

1～9.布魯氏菌牛種2308、牛種A19、羊種16M、羊種M5、羊種M28、豬種S2、豬種S1330、犬種RM6/66、犬種ZG；NS代表陰性對照

2.4 ddPCR重復(fù)性試驗(yàn)

選取4個濃度的布魯氏菌感染臨床樣品的核酸為模板進(jìn)行微滴數(shù)字 PCR 反應(yīng)，每個濃度設(shè)立3個重復(fù)孔，計算得到其批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.92%、4.03%、4.92%和4.77%，說明ddPCR方法的批內(nèi)重復(fù)性好；在同樣的反應(yīng)條件下進(jìn)行3 次試驗(yàn)，計算得到其批間變異系數(shù)分別為3.67%、4.60%、6.53%和7.20%，說明ddPCR方法的批間重復(fù)性好，檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

2.5 臨床樣品檢測

應(yīng)用細(xì)菌培養(yǎng)方法(動物布魯氏菌病診斷技術(shù)，GB/T 18646-2018)和本研究建立的布魯氏菌ddPCR方法分別對136份牛陰道拭子樣品進(jìn)行鑒定和檢測。結(jié)果顯示，兩種方法均檢測到陽性樣品78份，陰性樣品58份，兩種方法的符合率為100%。使用布魯氏菌ddPCR方法可以測得這78份陽性樣品的拷貝數(shù)為1.4～20.4 copies·μL-1，說明本方法實(shí)現(xiàn)了對樣品中細(xì)菌含量的絕對定量檢測。

1～6. 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9菌株、大腸桿菌O:157菌株、沙門氏菌都柏林菌株、沙門氏菌1791菌株、傷寒沙門氏菌、羊種布魯氏菌16M

3 討 論

自1985年聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)問世以來，PCR 技術(shù)作為一種快速、高效、簡便的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、食品衛(wèi)生等多個領(lǐng)域[12-13]，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，定量PCR技術(shù)也在更新?lián)Q代，從傳統(tǒng)的定量PCR逐漸發(fā)展到數(shù)字PCR[6]。與傳統(tǒng)的PCR 方法相比，數(shù)字PCR方法更加靈敏，可以在樣品濃度較低時，發(fā)現(xiàn)目的片段，不需要依賴CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線而實(shí)現(xiàn)絕對核酸定量[11，14]。近幾年，數(shù)字化PCR 方法在微生物研究和診斷中發(fā)揮了廣泛作用[11]，趙麗清等[15]利用數(shù)字 PCR 技術(shù)建立了可定量檢測食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法；董蓮華等[16]以出血性大腸桿菌O157∶H7的rfbE基因?yàn)槟繕?biāo)基因，構(gòu)建了可以準(zhǔn)確定量檢測腸出血性大腸桿菌的ddPCR方法。雖然數(shù)字PCR方法仍存在一定的缺陷，如檢測時間長、通量有待進(jìn)一步提高等，但隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用前景也會更加廣泛。

對于布魯氏菌的診斷，血清學(xué)方法主要用于抗體檢測，且容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，判定結(jié)果多出現(xiàn)假陰性或假陽性[17]，細(xì)菌分離雖然是布魯氏菌病檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，但由于其操作繁瑣、周期長、危險性較大，已不適用于獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室對該病快速、簡便檢測的需求。本研究選取布魯氏菌的保守序列設(shè)計引物，通過對引物、探針濃度以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，建立了布魯氏菌數(shù)字PCR檢測方法。該方法靈敏度高，最低檢測限達(dá)到單個拷貝，靈敏度高于熒光定量；特異性強(qiáng)，9株不同種屬的布魯氏菌菌株均能被檢測到，而與大腸桿菌O:157菌株等其他4種細(xì)菌均無交叉反應(yīng)；重復(fù)性好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%；可實(shí)現(xiàn)對臨床樣品的絕對定量，特別是對于低細(xì)菌載量樣品的檢測，數(shù)字PCR可作為熒光定量PCR的重要補(bǔ)充，為布魯氏菌的診斷和防控提供可靠保障。

4 結(jié) 論

建立了布魯氏菌數(shù)字PCR檢測方法，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，為布魯氏菌病的準(zhǔn)確檢測和診斷提供了技術(shù)儲備。