豬瘟病毒化學發光抗體檢測方法的建立與應用

麻 園，石正旺，羅俊聰，楊 波，王麗娟，萬 穎，宋 銳，曹麗艷，周改靜，田 宏，鄭海學*，陳軼霞*

(1.西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030； 2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所 國家重點實驗室，蘭州 730046)

豬瘟(classical swine fever, CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一種急性、熱性、高度傳染性的豬病毒性疾病[1-2]。世界動物衛生組織(Office International Des Epizooties, OIE)將其列為須通報疫病，我國將其列為一類動物疫病。CSFV是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員之一，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約12.5 kb[3-4]。CSFV基因組含有一個開放閱讀框，編碼1個含3 898個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白被病毒和宿主細胞蛋白酶加工成12個成熟蛋白，包括4個結構蛋白(C、Erns、E1、E2)和8個非結構蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[5-7]。E2蛋白是CSFV的囊膜糖蛋白，也是CSFV的主要保護性抗原蛋白，去糖基分子量為42 ku，用E2蛋白免疫豬時，可刺激宿主機體產生中和抗體從而提供針對CSFV的免疫保護[8-9]。

豬瘟是世界范圍內流行的豬病毒性疾病，該病的高發病率和高死亡率對豬養殖業造成了巨大的經濟損失，盡管有些地區已經根除，但在根除和流行的邊界地區及一些野豬群中仍然存在豬瘟的點狀散發流行[10]。因此，豬瘟仍是危害全球養豬業的一個重要流行性疾病。在預防豬瘟方面，早期檢測對防制該病的暴發至關重要。目前，病毒中和試驗(VNTs)、熒光抗體試驗(FATs)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、病毒分離、逆轉錄鏈式聚合酶反應(RT-PCR)等均是OIE官方推薦的CSFV診斷方法[11-13]，其中，ELISA是CSFV血清學診斷中最為主要的方法，但傳統的ELISA操作時間較長，不能滿足臨床高通量快速檢測的要求。

化學發光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)是基于免疫反應原理，結合化學發光檢測技術而建立的一種免疫檢測技術[14]。與ELISA相比，CLIA具有特異性強、檢測線性范圍寬、檢測效率高、操作簡便、反應時間短、可實現高通量和自動化檢測等優點[15]，并且靈敏度提高了6個數量級[16]。目前，CLIA作為一種特異性強、靈敏度高、簡單快速的檢測方法已在醫學領域得到廣泛應用，但在動物疫病檢測方面仍處于發展階段，應用尚不廣泛[17]。

為了實現CSFV抗體的高特異性、高靈敏性的快速檢測，本研究以CHO細胞表達的E2蛋白作為包被抗原，山羊抗豬IgG-HRP抗體作為酶標抗體，魯米諾作為發光底物溶液，成功建立了一種高特異性、高靈敏性、準確快速的CSFV化學發光抗體檢測方法，該方法可廣泛用于臨床血清樣品的CSFV抗體檢測。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

采自甘肅省康樂縣某豬場的92份背景清晰豬血清樣品(56份陽性和36份陰性)均經兩種商品化ELISA試劑盒檢測、1份CSFV抗體陽性對照血清(中和效價為1∶600)、1份CSFV抗體陰性對照血清、1份標準陽性血清(由陽性對照血清1∶20稀釋獲得)、1份標準陰性血清(由陰性對照血清制備)、A型口蹄疫病毒抗體陽性血清、O型口蹄疫病毒抗體陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性血清、塞內卡病毒抗體陽性血清、非洲豬瘟病毒抗體陽性血清均由中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜病原學國家重點實驗室制備與保存；152份田間豬血清樣品采自不同豬場。

1.2 主要試劑與儀器

豬瘟病毒抗體檢測試劑盒(批號:99-43200)購自IDEXX公司；豬瘟病毒抗體檢測試劑盒購自深圳芬德生物技術有限公司；豬瘟病毒(GenBank ID: AF092448)E2蛋白胞外區由本實驗室通過CHO細胞表達制備；96孔化學發光板購自北京博生欣科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自TaKaRa公司；海藻糖購自南寧中諾生物公司；抗體稀釋液(批號：17032206)購自濟南百迪泰生物科技有限公司；山羊抗豬IgG-HRP抗體購自上海群己生物科技有限公司；魯米諾發光底物液購自Thermo公司；化學發光免疫分析儀購自上海鳴捷生物科技有限公司。

1.3 抗原E2蛋白最佳包被濃度及血清樣品稀釋倍數的確定

將原始濃度為0.68 mg·mL-1E2蛋白用包被液從1∶100倍比稀釋包被96孔化學發光板，4 ℃包被12 h。將陽性對照血清和陰性對照血清用樣品稀釋液分別稀釋成1∶50、1∶100、1∶200、1∶300 4個梯度，每孔加入50 μL血清，室溫反應10 min， 棄液，加入240 μL 1×PBST溶液洗4次，棄液拍干。用抗體稀釋液(批號：17032206)將山羊抗豬IgG-HRP抗體1∶120 000稀釋，每孔加入50 μL，室溫反應10 min，棄液，加入240 μL 1×PBST溶液洗4次，棄液拍干。每孔加入100 μL魯米諾底物溶液，讀取化學發光值。根據陽性血清發光值/陰性對照血清發光值(P/N值)最大為最佳條件原則，確定E2蛋白的最佳包被濃度及血清樣品最佳稀釋倍數。

1.4 樣品稀釋液的篩選

分別選?。孩?%BSA(PBST溶液)，②1% BSA[0.9%NaCl，0.5%Tween-20，0.05 mol·L-1MOPS(pH7.0)]，③1%BSA[0.9%NaCl，0.5%Tween-20，1%海藻糖，0.05 mol·L-1MOPS(pH7.0)]作為樣品稀釋液，用這3種稀釋液對陽性對照血清和陰性對照血清1∶200稀釋。將稀釋好的血清加入化學發光板進行檢測，讀取化學發光值并計算分析P/N值。根據最大P/N值為最佳條件原則，篩選最佳樣品稀釋液。

1.5 封閉液的篩選

分別選?。孩?.5% BSA(1.5 g BSA，100 mL PBST溶液)，②5%脫脂奶粉(5 g脫脂奶粉，100 mL TBST溶液)，③ 2%海藻糖(2 g海藻糖，1%酪蛋白，100 mL PBS溶液)作為封閉液，每孔加入120 μL封閉液，4 ℃封閉10 h。用制備好的化學發光板檢測陰陽性對照血清，讀取化學發光值并計算分析P/N值。根據最大P/N值為最佳條件原則，篩選最佳封閉液。

1.6 封閉條件的確定

在4 ℃分別設置6、8、10、12 h等不同封閉條件，按照以上所設置封閉條件用③封閉液進行封閉。用封閉好的化學發光板檢測陰陽性對照血清，讀取化學發光值并計算分析P/N值，根據最大P/N值為最佳條件原則，確定最佳封閉條件。

1.7 反應條件的確定

將反應條件設置為37 ℃ 5、10、15、20 min和室溫 5、10、15、20 min，按照所設計的不同反應條件對陰陽性對照血清進行檢測，讀取化學發光值并計算分析P/N值。依據最大P/N值為最佳條件原則，確定最佳反應條件。

1.8 酶標抗體最佳稀釋倍數的確定

用抗體稀釋液將酶標抗體稀釋成1∶10 000、1∶20 000、 1∶40 000、1∶80 000、1∶120 000、1∶160 000、1∶200 000等不同濃度梯度。按照設計的不同條件對陰陽性對照血清進行檢測，讀取化學發光值，并計算分析P/N值，依據P/N值最大為最佳條件原則，確定酶標抗體的最佳稀釋倍數。

1.9 判定標準的確定

用本研究建立的方法檢測92份背景清晰的豬血清樣品(56份陽性血清和36份陰性血清)，使用SPSS 17.0軟件將化學發光值繪制成橫坐標為1-特異性和縱坐標為敏感度的ROC(receiver operating characteristic)曲線，并以約登(Youden)指數[Youden指數=敏感性-(1-特異性)]最大時所對應的化學發光值作為臨界值(CO值)[18]。

1.10 特異性試驗

用本研究建立的CSFV化學發光抗體檢測方法對A型口蹄疫病毒(FMDV A)、O型口蹄疫病毒(FMDV O)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、塞內卡病毒(SVA)、非洲豬瘟病毒(ASFV)抗體陽性血清進行檢測，并設置CSFV抗性陽性血清作為對照。讀取化學發光值并分析計算S/CO值，判定待檢血清樣品的陰陽性，從而分析本方法的特異性。

1.11 靈敏性試驗

用本研究建立的化學發光檢測方法和市售IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒分別檢測1∶200、1∶2倍 比稀釋的陽性對照血清(中和抗體效價為1∶600)， 讀取化學發光值并分析計算S/CO值，判定陰陽性，并與市售IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒檢測結果進行對比，從而分析本方法的靈敏性。

1.12 重復性試驗

1.12.1 批內重復性試驗 選取6份血清樣品(3份CSFV抗體陽性血清和3份CSFV抗體陰性血清)，用同批包被的化學發光板檢測6份血清樣本，讀取化學發光值并分析計算變異系數。

1.12.2 批間重復性試驗 選取2份血清樣品(1份CSFV抗體陽性血清和1份CSFV抗體陰性血清)，用3個不同批次化學發光板檢測2份血清樣本，讀取化學發光值并分析計算變異系數。

1.13 臨床樣本的檢測

用本研究建立的CSFV化學發光抗體檢測方法和商品化CSFV抗體檢測試劑盒共同檢測152份田間豬血清樣品，讀取化學發光值并分析計算Kappa值。當0

2 結 果

2.1 抗原E2蛋白最佳包被濃度及血清樣品最佳稀釋倍數的確定

利用棋盤滴定法對抗原E2蛋白最佳包被濃度及最佳血清稀釋倍數進行優化。結果顯示，當E2蛋白和血清稀釋倍數均為1∶200稀釋時，P/N值最大。通過BCA法測定E2蛋白初始濃度為0.68 mg·mL-1(圖1)，因此E2蛋白的最佳包被濃度為3.4 μg·mL-1，血清樣品的最佳稀釋倍數為1∶200。

M.蛋白相對分子質量標準；1. 純化后E2蛋白；2. E2蛋白與CSFV抗體陽性血清反應原性鑒定；3. E2蛋白與CSFV抗體陰性血清反應原性鑒定

2.2 樣品稀釋液的篩選

用①、②、③樣品稀釋液分別按照最佳稀釋倍數對血清樣品進行稀釋，將稀釋好的陰陽性對照血清加入化學發光板檢測。讀取化學發光值并分析計算P/N值，比值最大時的樣本稀釋液為最佳樣品稀釋液。結果表明，用②樣品稀釋液稀釋血清樣品時，P/N值最大。因此，最佳樣品稀釋液為1%BSA。

2.3 封閉液的篩選

將已包被好的化學發光板用①、②、③3種不同的封閉液4 ℃ 封閉10 h。用本批次包被的化學發光板檢測以最佳稀釋倍數稀釋的陰陽性對照血清，讀取化學發光值并分析計算P/N值。P/N值最大時該封閉液則為最佳封閉液。結果表明，③封閉液封閉時，P/N值最大。因此，最佳封閉液為2%海藻糖。

2.4 封閉條件的確定

用2%海藻糖按照所設計條件封閉化學發光板，通過對陽性對照血清和陰性對照血清檢測，讀取化學發光值并分析計算P/N值。結果表明，在4 ℃封閉8 h時，P/N值最大，證實了4 ℃封閉8 h為最佳封閉條件。

2.5 反應條件的確定

按照所設置的反應條件對陰陽性對照血清進行檢測，讀取化學發光值并分析計算P/N值。結果表明，在室溫反應10 min條件下，P/N值最大。因此，最佳反應條件為室溫反應10 min(圖2)。

圖2 反應條件的篩選結果

2.6 酶標抗體稀釋倍數的確定

用抗體稀釋液將酶標抗體分別稀釋成1∶10 000、 1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶120 000、1∶ 160 000、1∶200 000 7個梯度。在最佳反應條件下，檢測陰陽性對照血清，讀取化學發光值并分析計算P/N值。結果表明，酶標抗體1∶40 000稀釋時，P/N值最大。因此，酶標抗體最佳稀釋倍數為1∶40 000 (圖3)。

圖3 酶標抗體稀釋倍數的篩選結果

2.7 判定標準的確定

利用SPSS 17.0軟件將化學發光值繪制成ROC曲線(圖4)，并分析計算每個化學發光值Youden指數。Youden指數最大時為0.946，特異性為100%，靈敏性為94.6%，所對應的化學發光值為42 378.5，即臨界值為42 378.5。分別檢測1份標準陽性血清和1份標準陰性血清各重復8次，計算化學發光值的平均值。標準陽性血清化學發光值的平均值為293 691.1，標準陰性血清發光值的平均值為14 454.8，設定標準陽性發光值系數(a)為0.1時，標準陰性血清發光值系數(b)為0.9，此時兩者之和為42 378.5，與CO值42 378.5一致。當S/CO ≥1時，判定為陽性；當S/CO <1時，則判定為陰性。

圖4 ROC曲線繪制結果

2.8 特異性試驗

用本研究建立的CSFV化學發光抗體檢測方法，對FMDV A型、FMDV O型、PRRSV、SVA、ASFV抗體陽性血清和CSFV抗體陽性血清進行檢測，讀取化學發光值并判定陰陽性。結果表明，以上5種豬病抗體陽性血清的S/CO值均小于1，為CSFV抗體陰性血清，證實了本研究建立的CSFV化學發光抗體檢測方法與這5種豬病并無交叉反應，具有較好的特異性。

2.9 靈敏性試驗

用本研究建立的CSFV化學發光抗體檢測方法和市售IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒檢測倍比稀釋的陽性對照血清，讀取化學發光值并分析計算S/CO值，判定陰陽性，與IDEXX CFSV 抗體檢測試劑盒檢測結果對比，從而分析本方法的靈敏性。結果表明，本方法的最低稀釋度為1∶6 400，而IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒的最低稀釋度為1∶64，因這兩種方法分別是在1∶200和1∶2的基礎上稀釋，故靈敏度相當。

2.10 重復性試驗

在最佳條件，用本研究建立的化學發光檢測方法對6份血清樣品(陽性血清和陰性血清各3份)進行檢測，以評估該方法的批內重復性。選取3個不同生產批次的發光板對2份血清樣品(陽性血清和陰性血清各1份)進行檢測，用于批間重復性的評估。每個血清設置4個平行孔，讀取化學發光值并分析計算變異系數。結果顯示，批內變異系數為1.80%～6.88%，批間變異系數為1.11%～9.18%，批內及批間變異系數均小于10%，表明本研究建立的CSFV化學發光抗體檢測方法重復性好(表1)。

表1 重復性試驗結果

2.11 臨床樣本的檢測

用本研究建立的CSFV化學發光抗體檢測方法與商品化CSFV抗體檢測試劑盒共同檢測152份田間豬血清樣品，讀取化學發光值并分析計算Kappa值。結果表明，Kappa值為0.929>0.75，說明本研究建立的CSFV化學發光抗體檢測方法具有高度一致性(表2)。

表2 比對試驗結果

3 討 論

迄今為止，豬瘟在全球多個國家已得到基本控制，但某些地區仍存在豬瘟點狀散發流行、種豬的嚴重帶毒，并通過胎盤傳染導致仔豬的先天性帶毒以及后備豬潛伏帶毒形成亞臨床感染，這是豬瘟在豬場持續發生的重要原因，也給豬瘟的根除和凈化工作帶來了巨大的挑戰[20]。目前，我國對豬瘟的防控主要以豬瘟兔化弱毒疫苗和亞單位E2蛋白重組疫苗免疫接種，結合抗體水平監測，因而CSVF血清學診斷顯得尤為重要。E2蛋白是CSFV主要保護性抗原，能夠誘導機體產生中和抗體，提供保護性免疫，從而能有效抵御豬瘟強毒的攻擊[21]。因此，E2蛋白常被用作CSFV血清學診斷和疫苗開發研究的對象之一[22]。

ELISA是CSFV血清學診斷中最為常用的檢測方法，但其在檢測線性范圍小、操作時間長等方面的不足[23]，在很大程度上降低了高通量檢測的效率。CLIA作為一種高特異性、高靈敏性、快速簡單準確的檢測方法，不僅符合食品、生物醫學等領域的快速靈敏檢測的需求，更是在獸醫、動物疫病檢測上具有廣泛的潛在應用價值[23]。Tan等[24]用CLIA、商品化ELISA試劑盒和以重組人源α3(IV)NC1蛋白包被自制的ELISA檢測31例抗腎小球基底膜(anti-GBM)疾病患者體內的anti-GBM抗體，檢測結果一致性較好，但在疑似患者檢測上，CLIA要優于商品化ELISA試劑盒。熊玲紅等[25]用化學發光法和酶聯免疫法(ELISA)檢測新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)并對兩種方法進行比較，結果表明，化學發光和 ELISA 檢測方法對SARS-CoV-2 IgG檢測的靈敏度均高于SARS-CoV-2 IgM，并且化學發光檢測靈敏度要高于 ELISA方法。

ELISA檢測試劑盒CO值的設定方法大多采用陰性樣品OD450 nm均值±2s或3s，這種方法可能會導致假陰性比例過高，從而影響結果判定的準確性[26]。ROC曲線是一種兼顧靈敏度和特異性設定CO值的好方法，其主要通過Youden指數來篩選最佳的CO值，當Youden指數越大時，真實性越高[27]。本研究應用ROC曲線篩選最佳的CO值具有較好的科學性和真實性。Kappa值是檢驗兩個檢測方法一致性的重要指標，Kappa值越大時，兩種檢測方法的一致性越高[28-29]。應用Kappa一致性檢驗分析不同豬瘟抗體檢測試劑盒檢測結果一致性，比國內同類研究更加科學[30]。本研究建立的CSFV化學發光抗體檢測方法與常規ELISA相比，不僅能在20 min完成對田間血清樣品中CSFV抗體的檢測，還能在加入魯米諾發光底物之后直接讀取化學發光值，省去終止反應這一步驟，縮短了檢測時間。本文成功建立的CSFV化學發光檢測方法不僅具有特異性強、靈敏性高、快速簡單準確等優點，并且能極大地提高了CSFV抗體檢測的效率，也為化學發光檢測方法在其他動物疫病檢測方法上的應用提供了參考。

4 結 論

成功建立了基于E2蛋白的CSFV化學發光抗體檢測方法，該方法不僅具有高特異性、高靈敏性，并且能在20 min完成對田間血清樣品中CFSV抗體的檢測，極大地提高了高通量檢測的效率。