羊蜱蠅攜帶巴爾通體和斑點熱群立克次體PCR檢測及遺傳關(guān)系分析

向 陽，袁東波，侯 巍，莫 茜，尹 杰，陽愛國，郝力力*

(1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2. 四川省動物疫病預(yù)防控制中心，成都 610041)

羊蜱蠅(Melophagusovinus)，屬昆蟲綱(Insecta)、雙翅目(Diptera)、虱蠅科(Hippoboscidae)、蜱蠅屬(Melophagus)[1]。羊蜱蠅是一種以吸食宿主血液為生的體外寄生蟲，除熱帶地區(qū)外，廣泛分布于世界各地。羊蜱蠅通常寄生在綿羊體表，有報道稱羊蜱蠅的宿主范圍有擴大趨勢，可寄生于人類以及更廣泛的家畜(綿羊、藏綿羊、山羊和犬)，野生動物(歐洲野牛、藏羚羊、野兔和紅狐)[2-3]。藏綿羊感染羊蜱蠅后，一方面，降低生產(chǎn)性能；另一方面，作為傳播媒介可儲存或傳播巴爾通體、立克次體、藍(lán)舌病病毒、綿羊無漿體、錐蟲等病原[4]。近年來國內(nèi)僅在甘肅、新疆、遼寧、青海和西藏部分地區(qū)有少量報道[5]。

巴爾通體(Bartonella)是一類兼性胞內(nèi)寄生的多形態(tài)革蘭陰性菌，可感染人、牛、羊、鼠等多種哺乳動物，世界各地均有分布。巴爾通體病作為新發(fā)人畜共患病，已被列入國家新發(fā)傳染病目錄。巴爾通體主要寄生于動物的上皮細(xì)胞和紅細(xì)胞中，可經(jīng)跳蚤、蜱蟲、白蛉、羊蜱蠅等吸血昆蟲傳播[6]。斑點熱群立克次體(spotted fever group rickettsiae，SFGR)是一類專性胞內(nèi)寄生的多形態(tài)革蘭陰性菌，可經(jīng)蜱蟲、螨蟲、跳蚤等吸血昆蟲傳播，世界各地均有分布[7]。目前，已證實自然界存在15種以上的巴爾通體和16種以上的斑點熱群立克次體對人有致病性，包括Bartonellamelophagi、B.henselae、B.elizabethae和B.rochalima[6]，Rickettsiaraoultii、R.slovaca、R.felis、R.aeschlimannii和R.massiliae[8]等，這些病原具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本教研室前期曾就石渠縣牦牛源蜱感染巴爾通體和斑點熱群立克次體開展分子流行病學(xué)調(diào)查，但未對石渠縣羊蜱蠅是否也攜帶這2類病原進(jìn)行調(diào)查[9-10]。因此，本研究以石渠縣藏綿羊體表寄生的羊蜱蠅為研究對象開展調(diào)查，以期進(jìn)一步掌握巴爾通體和斑點熱群立克次體感染情況，為當(dāng)?shù)厝双F共患病的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 羊蜱蠅采集 2018年6—8月，分別在四川省石渠縣阿日扎鎮(zhèn)、呷衣鄉(xiāng)、新榮鄉(xiāng)和長沙貢馬鄉(xiāng)4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的96只藏綿羊體表采集羊蜱蠅，樣本采集點見圖1。分別從21、25、25、25只藏綿羊體表采集到羊蜱蠅96、87、121、103只，共計407只，按照地點分別裝入收集管，塞入潮濕脫脂棉。將蟲體送至西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院動物寄生蟲教研室，浸于75%乙醇溶液后置4 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

圖1 石渠縣樣本采集點位置

1.1.2 主要試劑 組織基因組DNA提取試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit)、1 (TAE溶液、2 (Easy Taq PCR SuperMix、核酸染色劑、瓊脂糖和DNA Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；巴爾通體陽性對照(B.melophagi)和斑點熱群立克次體陽性對照(R.slovaca)由西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院動物寄生蟲教研室保存，引物合成及測序均由生工生物工程(成都)有限公司完成。

1.1.3 主要儀器 體視顯微鏡(Leica S9D)，多功能生物樣品均質(zhì)器(Bertin Precellys 24)，臺式高速離心機(Eppendorf 5402型)，Bio-Rad伯樂梯度PCR擴增儀(RTC240型)，電泳儀(DYY-6C型)，全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon-5200 Multi)。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 根據(jù)《中國經(jīng)濟昆蟲志》(第三十九冊)[11]及《中國畜禽寄生蟲形態(tài)分類圖譜》[12]，在體視顯微鏡下觀察羊蜱蠅形態(tài)學(xué)特征并拍照。

1.2.2 DNA提取 將羊蜱蠅從75%乙醇溶液中取出，無菌水沖洗3次。無菌濾紙吸干，沿縱向中軸線對剖，分別裝入EP管。取半只加入500 μL無菌水，置于Bertin Precellys 24研磨器進(jìn)行充分研磨，參數(shù)設(shè)置如下：每管加入陶瓷珠(直徑0.5 mm的20珠、直徑2 mm的5珠)，5 500 g研磨2次；4 000 g 研磨1次。取研磨液200 μL，根據(jù)組織基因組DNA提取試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit)使用說明書提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。另外半只?80 ℃冰箱凍存。

1.2.3 PCR擴增 巴爾通體和斑點熱群立克次體的分子鑒定分別采用Norman[13]、Paziewska[14]、Oteo[15]、Fernndez[16]等報道的方法，引物信息見表1。4對引物擴增的總體系均為25 μL：模板1 μL(2～3 ng)， 上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，PCR Supermix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。每個PCR反應(yīng)均設(shè)置1個陽性對照(B.melophagi或R.slovaca)和1個陰性對照(ddH2O)。PCR的反應(yīng)程序：92 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，40個循環(huán)；72 ℃最后延伸7 min。 取2 μL PCR擴增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中100 V電泳30 min，所得PCR陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(成都)有限公司進(jìn)行測序。

表1 巴爾通體和立克次體PCR引物信息

1.2.4 序列分析及統(tǒng)計分析 將所得序列用DNA Star V.7.1.0進(jìn)行拼接與分析，在NCBI中使用BLAST對序列進(jìn)行比對，再應(yīng)用MEGA 6. 0軟件以鄰接法(bootstrap值為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并以Kimura 2-parameter模型計算序列間的遺傳距離。采用SPSS 20. 0(皮爾森卡方檢驗)比較不同采樣地點巴爾通體和立克次體感染率的差異，P≤0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 羊蜱蠅采集數(shù)量及形態(tài)觀察

在阿日扎鎮(zhèn)，86只藏綿羊中有21只感染了羊蜱蠅；在呷衣鄉(xiāng)，60只藏綿羊中有25只被感染；在新榮鄉(xiāng)，98只藏綿羊中有25只被感染；在長沙貢馬鄉(xiāng)，137只藏綿羊中有25只被感染。在4個采樣點96只藏綿羊體表共采集到羊蜱蠅成蟲407只，未采集到羊蜱蠅蛹及幼蟲。羊蜱蠅的形態(tài)特征如圖2所示。

A. 雌性羊蜱蠅背面；B. 雌性羊蜱蠅腹面；C. 雄性羊蜱蠅背面；D. 雄性羊蜱蠅腹面

2.2 巴爾通體gltA、rpoB基因的PCR擴增

以“1.2.2”中提取的羊蜱蠅組織DNA為模板，分別擴增巴爾通體gltA、rpoB基因片段，長沙貢馬鄉(xiāng)部分樣本電泳如圖3所示，片段大小分別約356、379 bp，與預(yù)期相符。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 陽性對照；2～9(左圖)、2～8(右圖). 羊蜱蠅樣本；10(左圖)、9(右圖). 陰性對照

2.3 巴爾通體gltA、rpoB基因的遺傳進(jìn)化分析

所有的巴爾通體陽性產(chǎn)物均進(jìn)行了測序，使用DNA STAR軟件將所得巴爾通體gltA基因和rpoB基因序列進(jìn)行拼接、兩兩比對后得到1條gltA和5條rpoB的unique序列，分別上傳GenBank，得到對應(yīng)序列號(gltA：MN644897；rpoB：MN644898～MN644902)。分別選取不同種的巴爾通體和BLAST比對后相似性最高的gltA基因和rpoB基因序列等作為參考序列，構(gòu)建進(jìn)化樹。如圖4所示，從羊蜱蠅中檢測到的MN644897與美國內(nèi)華達(dá)州分離到的B.melophagi(AY724768)聚為1支，親緣關(guān)系最近，相似性為100.0%。從羊蜱蠅中檢測出的5條unique序列(MN644898～MN644902)與分離自美國西南部的B.melophagi(EF605288)聚為1支，相似性為98.8%～100.0%。參照La Scola等[17]建立的巴爾通體判定標(biāo)準(zhǔn)(gltA≥ 96.0%、rpoB≥ 95.4%)，本研究僅檢出了B.melophagi。見表2。

圖4 基于gltA (A)、rpoB (B) 基因巴爾通體系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 立克次體OmpA、OmpB基因的PCR擴增

以“1.2.2”中提取的羊蜱蠅組織DNA為模板，分別擴增立克次體OmpA、OmpB基因片段，長沙貢馬鄉(xiāng)部分樣本電泳如圖5所示，片段大小分別約530、618 bp，與預(yù)期相符。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 陽性對照；2～10(左圖)、2～9(右圖). 羊蜱蠅樣本；11(左圖)、10(右圖). 陰性對照

2.5 立克次體OmpA、OmpB基因的遺傳進(jìn)化分析

所有的立克次體陽性產(chǎn)物均進(jìn)行了測序，使用DNA STAR軟件將所得立克次體OmpA基因和OmpB基因序列進(jìn)行拼接、兩兩比對后得到4條OmpA和4條OmpB的unique序列，分別上傳GenBank，得到對應(yīng)序列號(OmpA：MN644903～MN644906；OmpB：MN644907～MN644910)。分別選取不同種的立克次體和BLAST比對后相似性最高的OmpA基因和OmpB基因序列等作為參考序列，構(gòu)建進(jìn)化樹。如圖6所示，OmpA基因序列分析表明序列MN644904～MN644906與R.raoultii(JQ792162和JQ792137)親緣關(guān)系最近，相似性為99.8%～100.0%。MN644903與從韓國分離到的CandidatusR.longicornii(MG906676)以及從青海分離到的unculturedRickettsiasp.(MG228270)序列相似性分別為98.2%、100.0%。OmpB基因序列分析表明序列(MN644907～MN644908)與R.raoultii(DQ365798)序列相似性為99.3%～99.5%；序列(MN644909～MN644910)與從韓國分離的CandidatusR.longicornii(MG906675)具有99.5%～100.0%的相似性。

圖6 基于OmpA (A)、OmpB (B) 基因立克次體系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.6 巴爾通體、斑點熱群立克次體的PCR檢測

本試驗中，首先使用gltA基因?qū)ρ蝌缦墧y帶的巴爾通體進(jìn)行初篩，然后使用rpoB基因篩選gltA基因陽性樣本。在407只羊蜱蠅中，有57只檢出了巴爾通體，感染率為14.0%(57/407)。在本次調(diào)查的4個鄉(xiāng)(鎮(zhèn))中，長沙貢馬鄉(xiāng)感染率最高，達(dá)16.5%，其余依次為新榮鄉(xiāng)15.7%、阿日扎鎮(zhèn)12.5%、呷衣鄉(xiāng)10.3%。經(jīng)χ2檢驗，不同鄉(xiāng)(鎮(zhèn))之間羊蜱蠅攜帶巴爾通體的感染率差異不顯著(P>0.05)，見表2。

OmpA是斑點熱群立克次體的特異性蛋白基因，參照Fournier等[18]建立的斑點熱群立克次體判定標(biāo)準(zhǔn)，若檢出OmpA即可直接判定為斑點熱群立克次體，若未檢出則需符合以下4項標(biāo)準(zhǔn)中的2項：OmpB相似性>85.8%、gltA相似性>92.7%、geneD相似性>82.2%、16S rRNA相似性>98.8%。該判定標(biāo)準(zhǔn)是本研究將OmpA、OmpB基因作為靶基因檢測斑點熱群立克次體的依據(jù)。調(diào)查結(jié)果顯示本研究中R.raoultii的感染率為11.1%(45/407)，見表2。在調(diào)查的4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，在阿日扎鎮(zhèn)、呷衣鄉(xiāng)和長沙貢馬鄉(xiāng)均檢出了R.raoultii，感染率分別為6.3%、16.1%和24.3%。結(jié)果顯示，長沙貢馬鄉(xiāng)羊蜱蠅攜帶R.raoultii的感染率(表2中以“*”標(biāo)記)顯著高于阿日扎鎮(zhèn)和呷衣鄉(xiāng)羊蜱蠅攜帶R.raoultii的感染率(P<0.05)。Rickettsiasp.與CandidatusRickettsialongicornii親緣關(guān)系密切，并僅在新榮鄉(xiāng)的樣本中檢出，感染率為6.6%(8/121)。在本研究中，沒有觀察到B.melophagi、R.raoultii和Rickettsia.sp.混合感染。

表2 石渠縣羊蜱蠅攜帶巴爾通體及斑點熱群立克次體的感染率

3 討 論

在本研究中使用rpoB和gltA基因?qū)ρ蝌缦墧y帶的巴爾通體進(jìn)行了鑒定，首次在分子水平上證實了石渠縣藏綿羊源羊蜱蠅存在B.melophagi感染。龍露等[19]對中國巴爾通體屬系統(tǒng)發(fā)育多樣性的分析結(jié)果顯示中國至少存在包含B.melophagi在內(nèi)的11個巴爾通體可感染人類。2007年，Bemis等[20]從美國商品化脫纖維羊血中檢出了B.melophagi。2009年，Maggi等[21]從2名有動物接觸史的病人的血液中分離出B.melophagi。近年來，在美國[22]、歐洲中部[23]和埃塞俄比亞[24]等國家和地區(qū)相繼報道了從羊蜱蠅中檢出B.melophagi。截至目前，尚未見石渠縣有關(guān)B.melophagi在羊蜱蠅中的報道。本研究從石渠縣的407個羊蜱蠅樣本中共檢出57例巴爾通體，陽性率為14.0%，經(jīng)鑒定均為B.melophagi。本研究的檢測結(jié)果低于周賽賽等[25]報道的西藏綿羊體表羊蜱蠅中B.melophagi的感染率(48.0%)、何波[26]報道的新疆及甘肅部分地區(qū)綿羊體表羊蜱蠅中B.melophagi的感染率(95.0%)和Liu等[5]報道的在南疆地區(qū)綿羊體表羊蜱蠅中B.melophagi的感染率(88.6%)。

巴爾通體具有不完全的宿主特異性，如B.elizabethae、B.vinsoniisubsp.Arupensis僅在嚙齒類動物中被檢出，B.vinsoniisubsp.Berkhoffii僅在犬科動物中被檢出，B.alsatic僅在兔中被檢出[27-29]。本研究從藏綿羊源羊蜱蠅中檢出的巴爾通體經(jīng)鑒定均為B.melophagi，未檢出其他種的巴爾通體。2019年唐天才等[10]在石渠縣牦牛源西藏革蜱和青海血蜱中也僅檢出了B.melophagi；2019年赫秀甜等[30]在四川省松潘縣牦牛源青海血蜱中同樣也僅檢出了B.melophagi，但在當(dāng)?shù)氐母咴笸弥袡z出了B.queenslandens、B.grahamii和Bartonellasp. 3種巴爾通體，未檢出B.melophagi。這表明羊蜱蠅和蜱等吸血節(jié)肢動物可能是B.melophagi的最適宜宿主，而高原鼠兔等嚙齒類動物可能并非是B.melophagi的最適宜宿主。

本研究首次在分子層面上證實了藏綿羊源羊蜱蠅攜帶R.raoultii。R.raoultii于1999年首次報道于前蘇聯(lián)，隨后在蒙古國、德國、意大利等地相繼報道[31]，在中國，R.raoutlii-like bacteria首次被報道于西藏[32]。R.raoutlii已被證實可感染人：2002年，8名法國人感染R.raoutlii[7]；2012年，在中國牡丹江從2名被蜱蟲叮咬的患者的血液中檢出了R.raoutlii[33]；2015—2016年，內(nèi)蒙古、河南和山東報道了26例人感染R.raoutlii的病例[34]。目前，R.raoultii主要是在蜱中被檢出，常見于蜱蟲中的鈍眼蜱屬、血蜱屬、硬蜱屬、革蜱屬、扇頭蜱屬[35]。在本研究中，有3個鄉(xiāng)的樣本中檢出了R.raoultii，感染率為6.3%～24.3%，顯著低于本教研室報道的石渠縣麻甲鄉(xiāng)、德榮瑪鄉(xiāng)、阿日扎鎮(zhèn)及長須干瑪鄉(xiāng)4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)牦牛源蜱(西藏革蜱和青海血蜱)中R.raoutlii的感染率(42.8%～58.3%)[9]。這可能是因為相對羊蜱蠅而言，R.raoutlii更適合在蜱內(nèi)生存。此外，本次調(diào)查的立克次體陽性樣本中存在6.6%(8/121)的未定種立克次體，后期本教研室擬將對其進(jìn)行培養(yǎng)，分離純化后應(yīng)用多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)等方法，基于立克次體多個基因(17 kDa、rrs、OspA和groEL)在種的水平上做進(jìn)一步鑒定。

在石渠縣，羊蜱蠅可能在藏綿羊間B.melophagi和R.raoultii的傳播過程中扮演了重要的角色。飼養(yǎng)方式粗放、牧民防護(hù)意識淡薄以及獸醫(yī)專業(yè)人員缺乏等因素都可能是造成當(dāng)?shù)匮蝌缦塀.melophagi和R.raoultii高感染率的原因。因此，接下來擬開展進(jìn)一步的研究，一是擴大調(diào)查范圍和樣本數(shù)量，二是密切關(guān)注當(dāng)?shù)啬撩袷欠裼邪l(fā)病的報道，以確定羊蜱蠅和藏綿羊在石渠縣B.melophagi和R.raoultii傳播中的確切作用。

3 結(jié) 論

石渠縣4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)共采集到羊蜱蠅成蟲407只。4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的樣品均檢出了Bartonellamelophagi，(總感染率為14.0%)；阿日扎鎮(zhèn)、呷衣鄉(xiāng)和長沙貢馬鄉(xiāng)檢出了Rickettsiaraoultii(總感染率為11.1%)；新榮鄉(xiāng)檢出了Rickettsiasp. (感染率為6.6%)。未發(fā)現(xiàn)混合感染。