GADD45β蛋白抑制ALV-J在DF-1細胞中的復制

陳 勝，廖志宏，謝 姿，陳 峰，謝青梅，舒 薇

(1. 華南農業大學動物科學學院 畜禽健康養殖與疾病防控實驗室，廣州 510642； 2.華南農業大學測試中心，廣州 510642)

禽白血病(avian leukosis，AL)是一種由禽白血病病毒(ALV)感染宿主引起的腫瘤性疾病，包括血管瘤、腎細胞瘤和結締組織瘤等[1-2]。在能夠感染禽的ALV中，根據囊膜蛋白的抗原模式，ALV被分為7個亞群(A～E、J和K)[3]。其中,J亞群禽白血病病毒(ALV-J)于1988年首次在英國報道[4]，由于其傳染性強，隨即迅速擴散到世界各地，成為養禽業重大病毒性疾病之一。ALV-J屬于逆轉錄病毒科α逆轉錄病毒屬的單股RNA病毒，原型株HPRS-103基因組長度為7.2 kb。其中，gag、pol和env基因分別編碼特異性抗原、多聚酶和囊膜蛋白(gp85和gp37)[5-6]。ALV-J可以水平傳播和垂直傳播，并且其水平傳播效率比其他ALV亞群更高[7]。由于缺乏疫苗保護，根除計劃是迄今為止唯一有效的控制ALV-J的方法[2]。

生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白45(growth arrest and DNA damage 45，GADD45)，包含了GADD45α、GADD45β/Myd118和GADD45γ 3種蛋白成員，其轉錄水平能在脅迫性生長停滯條件下增加[8]。GADD45β可參與調節腫瘤細胞多種生理進程，包括腫瘤生成及轉移、細胞自噬與細胞凋亡等[9-10]。研究表明GADD45β可通過作用于NF-κB，減少促炎性腫瘤相關巨噬細胞的激活和腫瘤內相關免疫細胞的浸潤，從而促進腫瘤的生成[11]。Myint等[12]在膽管癌中發現GADD45β蛋白可能參與EMT通路的調控和腫瘤轉移。最新研究表明GADD45β表達能影響卵巢漿液性囊腺癌患者的總生存時間，表明GADD45β可能參與化療誘導的凋亡或腫瘤免疫反應[13]。此外，本實驗室前期在ALV-J抗性基因篩選過程中發現了GADD45β的顯著上調[14]。這些研究結果均表明GADD45β與病毒感染及腫瘤生成密切相關。但是，GADD45β在ALV-J感染方面的具體研究鮮有報道。

本研究中，作者發現ALV-J感染可顯著上調GADD45β的表達水平。在DF-1細胞中，通過過表達試驗，作者發現GADD45β的上調能顯著抑制ALV-J的復制，而干擾GADD45β則促進了ALV-J的復制，這說明GADD45β具有抗ALV-J復制的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、病毒和質粒 雞胚成纖維細胞系(DF-1)和pRK5-Flag空載質粒，為華南農業大學動物科學學院畜禽健康養殖與疾病防控實驗室保存。ALV-J SD1005毒株為山東農業大學崔治中教授實驗室饋贈。

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌DH5α菌株購自上海唯地生物技術有限公司。DMEM培養基、0.25%胰酶、磷酸緩沖液PBS、Lip3000轉染試劑、羊抗兔IgG二抗均購自英濰捷基(上海)貿易有限公司。Flag標簽抗體與內參抗體均購自上海優寧維生物科技股份有限公司。gp37多克隆抗體由上海生工生物工程有限公司制備。SalⅠ和BamHⅠ限制性內切酶購自BioLabs公司。PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物技術有限公司。蛋白Marker、ECL發光液、ProLongTMGold Antifade Mountant with DAPI染料購自賽默飛世爾科技有限公司(中國)。4%多聚甲醛溶液和0.1%曲拉通X100購自開封市沛瑜生物科技有限公司。ALV抗原檢測ELISA試劑盒購自IDEXX生物科技有限公司。

1.2 總RNA的提取

Trizol法提取總RNA：在培養細胞的六孔板中加入適量Trizol試劑，裂解2 min，吹打轉移至2 mL離心管，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min。轉移上清至新的離心管，加入200 μL氯仿，混勻靜置5 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。轉移上清至新的離心管，加入等體積異丙醇，顛倒混勻靜置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。棄上清，加入75%乙醇，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min。棄上清，在通風櫥干燥5 min，加入適量DEPC水溶解RNA沉淀。

1.3 GADD45β真核表達質粒的構建

首先用PrimeScript RT試劑盒將總RNA進行兩步法反轉錄，得到cDNA。以cDNA為模板擴增GADD45β基因，在引物兩端加入SalⅠ和BamHⅠ酶切位點，引物序列： 5′-GGATCCATGACTCTGGAAGAGACGCA-3′(F)；5′-GTCGACTCACTCAGG TAAGGCAATAGTTGC-3′(R)。

將GADD45β擴增片段與pRK5-Flag線性化載體進行連接，構建pRK5-Flag-GADD45β真核表達質粒。之后進行轉化涂板，挑取單克隆菌落進行PCR鑒定，鑒定結果為陽性的菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，證實構建成功。

1.4 病毒感染

將DF-1細胞接種于培養皿中，待細胞密度達到70%～80%時，進行ALV-J SD1005毒株(103.6TCID50·0.1 mL-1) 感染試驗，感染2 h后換成含2%胎牛血清的維持液，繼續在37 ℃培養箱中培養。

1.5 Western blot

轉染一定時間后，收集細胞蛋白樣品，經SDS上樣緩沖液裂解樣品，于沸水中煮沸5 min后進行凝膠電泳。電泳時，設定電壓為80 V，待樣品壓成一條直線后，改為110 V恒壓直至結束。電泳結束后，將SDS-PAGE凝膠轉印至PVDF膜上，用5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉完成后，將相應蛋白抗體(Flag抗體、β-actin內參抗體、GADD45β抗體與gp37多克隆抗體，均為兔源抗體)經TBST 1∶1 000 稀釋后，室溫孵育1 h，經TBST洗滌3次，每次10 min， 再使用經TBST 1∶10 000稀釋的山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min，經TBST洗滌3次，每次5 min。最后，按照ECL發光液試劑盒的指示配制發光液，并使用超靈敏化學發光成像儀C600進行成像。

1.6 實時熒光定量PCR

以cDNA作為模板進行實時熒光定量PCR檢測，反應體系：10 μL SYBR Green，上下游引物各1 μL， 1 μL cDNA，7 μL DEPC水。反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共40循環。引物: 5′-GCCTTCTGCTGCGACAATGA-3′(GADD45β-qPCR-F)；5′-GGCTCTCGGCGCAGTAAT-3′(GADD45β-qPCR-R)。

1.7 間接免疫熒光試驗

將DF-1細胞接種于15 mm共聚焦培養皿，經轉染孵育一定時間后，進行樣品處理，步驟如下：棄液，PBS洗滌3次，加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min， 棄液經TBST洗滌3次后，加入500 μL 0.1%曲拉通X100穿孔15 min，棄液，經TBST洗滌3次后，加入500 μL 5%脫脂奶粉室溫封閉30 min，封閉完成后，將gp37多克隆抗體經TBST 1∶100稀釋后，室溫孵育1 h，經TBST洗滌3次，每次10 min， 再使用熒光抗兔二抗經TBST 1∶100稀釋后，室溫孵育1 h，再經TBST洗滌3次，每次10 min。最后，滴加一滴ProLongTMGold Antifade Mountant with DAPI染料，4 ℃保存或進行激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

收取待檢測細胞上清液，按照禽白血病病毒抗原檢測試劑盒(Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit)的步驟檢測p27 抗原。

1.9 GADD45β-siRNA干擾試驗

將DF-1細胞接種于六孔板，待密度為70%～80%時分別轉染2 μg的NC siRNA(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)和GADD45β siRNA(5′-CCAGAUAACGUGGCGUUCUTT-3′)，轉染24 h后，分別感染ALV-J SD1005毒株(103.6TCID50·0.1 mL-1)，在24、48、72 h不同時間點收取樣品用于后續檢測。

1.10 統計分析

使用Image Pro Plus 6.0軟件對Western blot條帶進行灰度分析。使用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行統計分析。采用Student-t檢驗組間差異。P<0.05為統計學意義上的顯著差異。

2 結 果

2.1 GADD45β真核表達質粒的構建及鑒定

利用引物對GADD45β基因進行PCR擴增后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測到509 bp擴增條帶(圖1A)，大小與預期相符。將經SalⅠ和BamHⅠ雙酶切的片段與pRK5-Flag載體連接，轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞，劃線涂板，挑取單克隆菌落進行PCR鑒定，如圖1B所示，檢測到509 bp擴增條帶，經測序正確，說明GADD45β真核表達質粒構建成功。

為了鑒定pRK5-Flag-GADD45β真核表達質粒是否能夠成功表達，將其與pRK5-Flag空載對照質粒分別轉染DF-1細胞，36 h收取細胞樣品，用Flag抗體進行Western blot檢測，檢測到18 ku條帶，大小與預期相符，證明pRK5-Flag-GADD45β在DF-1細胞中成功表達(圖1C)。為了進一步驗證這一結果，還通過激光共聚焦檢測了GADD45β的表達，并且觀察到其均勻分布于細胞核與細胞質中(圖1D)。

A. GADD45β PCR擴增；B. 菌液PCR鑒定；C. 蛋白質印跡法檢測pRK5-Flag-GADD45β質粒表達；D. 激光共聚焦檢測pRK5-Flag-GADD45β質粒表達及其細胞定位

2.2 ALV-J感染上調GADD45β的表達水平

將DF-1細胞接種于六孔板中，待細胞密度達到70%～80%時，進行ALV-J SD1005毒株(103.6TCID50·0.1 mL-1)感染試驗，分別收集24、48與72 h細胞樣品進行檢測。熒光定量PCR結果表明，ALV-J感染能顯著上調GADD45β的mRNA表達水平(圖2A)。同時，用Western blot方法檢測內源性GADD45β蛋白表達變化，如圖2B所示，ALV-J感染能顯著上調GADD45β的蛋白水平。對目的條帶進行了灰度分析(圖2C)，與對照組相比，攻毒組GADD45β/β-actin的比值顯著上調。為了進一步證明這一結果，還通過激光共聚焦檢測了GADD45β的蛋白表達情況。結果表明，ALV-J感染顯著上調了GADD45β的表達，并且改變了GADD45β的表達模式，從核質均勻分布轉移到主要分布于細胞質中(圖2D)。此外，我們前期研究表明在ALV-J攻毒后的雞體免疫器官中也檢測到了GADD45β基因的顯著上調[14]。總的來說，上述試驗結果說明了ALV-J感染能顯著上調GADD45β的表達水平。

A. 實時熒光定量PCR檢測GADD45βmRNA水平變化；B. Western blot檢測GADD45β蛋白水平變化；C.灰度分析GADD45β/β-actin比值；D. 激光共聚焦檢測GADD45β蛋白表達變化；*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001

2.3 過表達GADD45β抑制ALV-J的復制

為了驗證GADD45β過表達對ALV-J復制的影響，將GADD45β真核表達質粒轉染DF-1細胞，并于24 h后進行ALV-J SD1005毒株(攻毒劑量103.6TCID50·0.1 mL-1)感染試驗，收取24、48、72 h細胞蛋白進行Western blot檢測。結果表明(圖3A～C)，與空載對照組相比，過表達GADD45β顯著下調了gp37表達，即降低ALV-J的復制水平(圖3A)。灰度分析也進一步說明了這一結果(圖3C)。此外，我們收集了感染后第1～6天的細胞上清液進行ELISA檢測，SP值顯示感染后第2、3、5和6天，過表達組細胞上清p27抗原水平均顯著低于對照組(圖3B)。間接免疫熒光試驗也證明了GADD45β蛋白的過表達能下調ALV-J在DF-1細胞的復制水平(圖3D)。

A. Western blot檢測gp37蛋白水平變化；B. 灰度分析gp37/β-actin；C. ELISA檢測細胞上清p27抗原水平變化；D. 間接免疫熒光試驗檢測gp37蛋白表達變化(20×)；*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001

2.4 下調GADD45β促進ALV-J的復制

為了進一步探究GADD45β對ALV-J復制的影響，筆者還進行了GADD45β的干擾試驗。首先合成了3條GADD45β siRNA，并分別轉染DF-1細胞，轉染后48 h收集蛋白檢測GADD45β的表達水平，以驗證siRNA的干擾效率。結果如圖4A與4B所示，GADD45β siRNA-3的干擾效率最佳。

將GADD45β siRNA-3與NC siRNA分別轉染70%生長密度的DF-1細胞，并于轉染后24 h感染ALV-J SD1005(103.6TCID50·0.1 mL-1)，收集24、48、72 h細胞蛋白進行Western blot檢測。目的條帶及灰度分析結果表明，下調GADD45β的表達水平能顯著增加ALV-J的復制(圖4C與4D)。同樣的，我們收集了感染后第1～6 天的細胞上清液進行ELISA檢測，結果顯示，從第3 天開始，GADD45β siRNA組細胞上清液p27抗原水平顯著高于NC siRNA對照組(圖4D)。間接免疫熒光試驗結果也表明干擾GADD45β的表達能夠有效促進ALV-J的復制水平。

A. Western blot檢測siRNA 干擾效率；B. Western blot檢測gp37蛋白水平變化；C. 灰度分析siRNA干擾效率；D. 灰度分析gp37蛋白水平變化；E. ELISA檢測細胞上清p27抗原水平變化；F. 間接免疫熒光試驗檢測gp37蛋白表達變化(10×)；*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001

3 討 論

禽白血病是一種高度危害養禽業的傳染性疾病。ALV-J是典型的致瘤性逆轉錄病毒，其生命周期高度依賴宿主細胞蛋白。然而，很少有研究揭示負責ALV-J復制的宿主蛋白。最近的一項研究通過蛋白質組學發現CTHRC1(collagen triple helix repeat containing 1)與ALV-J的復制顯著相關，并且通過試驗證明了CTHRC1能夠抑制ALV-J的復制水平[15]。TRIM62(tripartite motif containing 62)同樣在限制ALV-J的復制中起著重要作用，并且其是通過靶向SPRY結構域而發揮抗病毒活性[16]。此外，chZAP(chicken zinc finger antiviral protein)在mRNA水平和蛋白水平上均能顯著抑制ALV-J在DF-1細胞上的復制[17]。宿主蛋白在ALV-J的復制過程中起著重要作用，但具體有哪些宿主蛋白參與其中還未可知，豐富這一過程對于ALV-J的抗病毒研究及開發新的抗病毒藥物具有重要意義。

GADD45β是公認的調節細胞自噬和細胞凋亡的功能性蛋白[9]，其能通過介導p38-MAPK/JNK信號通路的激活來響應環境壓力，維持細胞穩態。不僅如此，GADD45β還與細胞生長控制，以及細胞對DNA損傷的反應相關，缺乏GADD45β可能會導致腫瘤細胞的生長或凋亡[10]。例如，在肝癌中，GADD45β的下調水平就與腫瘤惡性程度的升高密切相關[18]。GADD45β已被鑒定為肝癌和慢性肝病的潛在分子標志物和治療靶標[19]。此外，在丙型肝炎病毒感染的小鼠模型中也發現了GADD45β的表達下調，且啟動子活性降低[20]。在腦垂體腫瘤中，GADD45β通過遏制腫瘤的增殖與存活被鑒定為腫瘤抑制因子[21]。這些研究充分證明GADD45β與腫瘤發生之間有著密切的聯系。本試驗前期研究也在致瘤性病毒ALV-J的抗性基因篩選過程中發現了GADD45β的差異表達[14]，但是其在ALV-J復制過程中的具體作用尚未報道。本研究表明，GADD45β與ALV-J的復制密切相關。ALV-J感染能顯著上調GADD45β的mRNA和蛋白表達水平。通過過表達GADD45β和siRNA敲低其表達水平，分別得到了抑制和促進ALV-J復制的結果，這表明GADD45β能夠抑制ALV-J的復制。在ALV-J感染DF-1細胞后，通過激光共聚焦檢測，筆者發現GADD45β的表達模式從核質均勻分布轉變為只在細胞質中表達。GADD45β本身無酶活性，其可通過蛋白間相互作用來執行其生理功能，如調節細胞增殖、細胞死亡和細胞存活等[22]。目前研究中發現GADD45β蛋白能與MEKK4結合，其蛋白可以從細胞核轉移至細胞質，進而介導p38MAPK/JNK途徑的激活來發揮其生理功能[23]。而p38MAPK和JNK信號通路的變化很可能是GADD45β發揮抗病毒作用的關鍵，這也是接下來研究的重點。

4 結 論

成功構建GADD45β真核表達質粒，且在DF-1細胞中成功表達并均勻分布于核質。ALV-J感染可顯著上調GADD45β的表達水平，提示GADD45β與ALV-J之間存在著緊密聯系。通過過表達與干擾試驗，發現GADD45β上調能顯著抑制ALV-J的復制，而干擾GADD45β的表達則能促進ALV-J在DF-1細胞上的復制水平。綜上所述， GADD45β能夠抑制ALV-J在DF-1細胞上的復制水平。