豬源組織蛋白酶S抑制O型口蹄疫病毒在PK-15細胞復制

史喜絹，劉原子，張大俊，侯 景，申超超，楊 博，張 婷，袁興國，任瑞瑞，杜曉華*，張克山*，鄭海學，劉湘濤

(1.甘肅農業大學動物醫學院,蘭州 730070； 2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 農業部畜禽病毒學重點開放實驗室 國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染偶蹄動物引起的一種烈性傳染病[1-3]。FMDV是微RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的成員，已知有O、A、C、Asia1和SAT1、SAT2、SAT3 7種血清型，成熟的FMDV粒子無囊膜，具有二十面體對稱性[4-6]。FMDV全基因組約為8 400 bp，含有一個大的開放閱讀框(ORF)，ORF編碼的多聚蛋白被病毒自身編碼的蛋白酶(L、2A、3C)切割成4個結構蛋白和8個非結構蛋白[7-9]。FMDV可利用自身編碼的蛋白進化形成抑制或逃避宿主先天性免疫反應，從而促進其自身在宿主體內的存活和復制[10]。FMDV前導蛋白酶(LPro)通過降低IFN-α/β和干擾素刺激因子的早期分泌水平，從而阻止宿主蛋白的合成[11]。FMDV 3A蛋白能抑制病毒觸發的IFN-β信號通路，從而逃避宿主免疫反應[12]。同樣，宿主也可以識別病原體并激發炎癥反應來抑制病毒復制[13]。已經發現有一些宿主蛋白在FMDV復制過程中起重要作用，如DCTN3與FMDV 3A結合負調控FMDV復制[14]。

CTSS是半胱氨酸蛋白酶家族中具有內切肽酶活性的重要成員，由N端16 aa信號肽(SP)、前肽和成熟肽331個氨基酸組成的非活化酶原，其活化需要蛋白酶裂解其N端前肽或由各種因素誘導[15]。CTSS酶活性是其發揮功能的關鍵，如棕櫚酸酯抑制組織蛋白酶誘導內皮細胞侵襲從而抗血管生成，部分是通過抑制CTSL和CTSS活性而起作用的[16]。CTSS的N端有3個凹槽(S1、S2 和S3)與底物的特異性結合相關，這一特性也決定了半胱氨酸蛋白酶抑制劑的特異性；該基因C端有一個與底物結合的位點，即S1’，在酶與主要組織相容性復合體二類分子(MHC-Ⅱ)保守區的特異性結合中起關鍵作用[17]。CTSS主要在樹突狀細胞、B細胞和巨噬細胞等抗原呈遞細胞中表達[18]，其參與細胞外基質、抗血管生成肽和黏附蛋白的降解，促進新生血管形成和腫瘤細胞侵襲轉移[19]。CTSS通過調節p38 MAPK和JNK1 途徑參與甲基原薯蕷皂苷(methyl protodioscin,MP)誘導的細胞凋亡和自噬[20]；通過激活NF-κB和caspase-3 從而誘導肝癌細胞凋亡并增加其化學敏感性[21]；也可通過激活CD74調控趨化因子CCL2的表達，進而對腫瘤微環境產生影響[22]。目前對CTSS的研究主要集中在自身免疫性疾病[23]、心血管疾病[24]及腫瘤相關疾病[25]，目前尚無有關病原體方面的報道。

初乳在抵抗病原感染中具有重要作用[26]。本團隊前期應用iTRAQ技術研究發現母豬初乳中CTSS的含量顯著高于常乳，但目前對宿主CTSS在病原感染中的作用研究較少，宿主CTSS在FMDV感染中的作用及其調控機制至今尚不明確。為闡明宿主CTSS在FMDV-O感染過程中發揮的作用，本研究探究了FMDV-O感染和宿主CTSS的相互調控作用，發現宿主CTSS能夠抑制FMDV-O在PK-15細胞中復制，而FMDV-O感染增加了宿主CTSS酶活性，進一步研究發現CTSS促進FMDV-O誘導的抗病毒細胞因子產生，明確了豬源CTSS抑制FMDV-O復制的初步原因。本研究結果為更深層次探究豬源CTSS在FMDV-O觸發的免疫應答中的作用機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

口蹄疫病毒毒株FMDV O/MYA98/BY/2010、PK-15細胞和FMDV-O抗體由蘭州獸醫研究所口蹄疫與新發病流行病學團隊保存；兔多克隆抗體CTSS購于Abcam公司；鼠抗Flag單抗、鼠抗Myc單抗、鼠抗β-actin單抗、HRP標記山羊抗鼠IgG二抗和HRP標記山羊抗兔IgG二抗均購于Thermo Scientific公司。

大腸桿菌DH5α感受態、LATaqDNA聚合酶、限制性核酸內切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶、RNA抽提試劑Trizol、5×Prime script RT Master Mix、SYBR Permix ExTaqII和蛋白預染Marker均購于寶生物工程大連有限公司； LipofectamineTM2000轉染試劑購于Invitrogen公司；Opti-MEM、0.25% EDTA胰酶和胎牛血清(FBS)均購于Gibco公司；MEM細胞培養液和PBS溶液購于建順公司；ECL顯色劑購于Thermo Scientific公司；NP-40裂解液和PMSF購于碧云天公司；織蛋白酶S試劑盒(貨號ab65306)購于艾博抗(上海)貿易有限公司；CTSS干擾序列由上海吉瑪制藥有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 CTSS真核表達質粒的構建 根據GenBank公布的CTSS基因序列(XM_021089893.1)設計合成CTSS引物，引入酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ，以pcDNA3.1為載體，構建pcDNA3.1-CTSS-Myc真核表達質粒，進行PCR擴增、酶切和序列測定。

1.2.2CTSS基因 RNAi序列設計與合成 根據GenBank公布的CTSS基因序列(XM_021089893.1)設計并合成CTSS RNAi序列。分別設計了3對針對CTSS基因的RNAi序列。

1.2.3 細胞瞬時轉染和病毒感染 將細胞消化后接種于細胞板中,待細胞長至70%～90%時，將質粒與Lip2000試劑(DNA∶Lip2000=1 μg∶2 μL) 分別加至Opti-MEM中，混合后靜置15 min，將Opti-MEM混合物直接加至細胞中，將細胞放于培養箱中培養數小時。用無血清的MEM清洗細胞，用無血清的MEM將FMDV-O稀釋至MOI為1.0時感染PK-15細胞，置于37 ℃、5%CO2培養箱孵育1 h之后，棄去病毒液，用含2% FBS的MEM維持液繼續培養。在感染后12 h收取2份細胞樣品，一份用于RT-qPCR，分別檢測CTSS和FMDV-O轉錄水平的變化，并以豬源GAPDH作為內參；一份用于Western blot，分別檢測CTSS和FMDV-O蛋白水平的變化，并以β-actin作為內參。

1.2.4 RT-qPCR 收集細胞樣品，采用Triozl法提取細胞總RNA，利用合成好的引物進行絕對定量和相對定量檢測[1]。相關定量擴增引物信息見表2。

表2 引物序列信息

1.2.5 CTSS酶活性測定 利用組織蛋白酶S活性檢測試劑盒(貨號ab65306；Abcam)提供的裂解液裂解細胞，離心取50 μL上清于96孔板，加等量反應緩沖液和10 mmol·L-1Ac-VVR-AFC(CTSS底物),根據試劑盒說明書進行處理。使用SpectraMax M5熒光計在400 nm激發波長和505 nm發射波長下測量熒光。

1.2.6 Western blot 收樣并處理細胞樣品，加入適量的NP-40裂解液(PMSF 1 mol·L-1)；充分裂解后，12 000 r·min-1離心10 min，取上清加入含β-巰基乙醇的5×SDS Loading Buffer，100 ℃變性10～15 min,按20 μL的上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳[1]，最后用高分辨圖像采集系統進行ECL顯影并保存結果。

1.2.7 數據分析 所有試驗至少重復3次，應用 GraphPad Prism 7軟件進行分析并作圖，運用獨立樣品T檢驗進行統計學分析，*.P<0.05表示數據具有統計學意義，**.P<0.01表示數據具有顯著性差異，***.P<0.001表示數據間具有極顯著性差異。

2 結 果

2.1 FMDV-O感染PK-15細胞促進內源性CTSS表達

將PK-15細胞鋪于35 mm小皿中，待細胞長至80%～90%，用MOI為1的FMDV-O感染PK-15細胞，在0、4、8、12 h后收取細胞樣品，利用RT-qPCR和Western blot方法檢測內源性CTSS的變化。結果表明FMDV-O感染PK-15細胞后內源性的CTSS蛋白水平(圖1A)和轉錄水平(圖1B)均高于對照組，提示FMDV-O感染可促進宿主細胞內源性CTSS的表達。

A. Western blot檢測CTSS蛋白水平的變化；B. RT-qPCR檢測CTSS轉錄水平的變化；*.P<0.05

2.2 CTSS重組質粒構建及表達驗證

構建pcDNA3.1-CTSS-Myc重組質粒，進行PCR擴增，用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定，10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測可在1 000 bp處見目的條帶，在5 000 bp 見載體條帶(圖2A)。經測序后進一步確定該真核質粒構建成功。將構建的pcDNA3.1-CTSS-Myc以不同的劑量分別瞬時轉染PK-15細胞，24 h后收取細胞樣品，處理樣品并進行Western blot驗證其表達情況，結果表明pcDNA3.1-CTSS-Myc重組質粒在PK-15細胞中呈劑量依賴性表達(圖2B)。

A. 雙酶切鑒定結果(M. DL5000 DNA相對分子質量標準；1. BamHⅠ和XhoⅠ酶切產物)；B. Western blot驗證CTSS蛋白在PK-15細胞表達

2.3 FMDV-O感染能上調CTSS酶活性

轉染0.25 μg CTSS重組質粒至PK-15細胞，20 h后用FMDV-O(MOI=1)感染細胞，同時設不用病毒刺激的Mock組，收取0、2、4、6、8、10、12、14 h 細胞樣品，裂解細胞用Fluorometric Method檢測CTSS酶活性。結果表明，FMDV-O感染能上調CTSS酶活性，且隨著FMDV-O感染時間的增加，CTSS的活性也隨之增加(圖3)。

圖3 FMDV-O感染上調CTSS酶活性

2.4 過表達CTSS能抑制FMDV-O復制

轉染1、2、4 μg pcDNA3.1-CTSS-Myc至PK-15細胞，轉染24 h后用MOI為1的FMDV-O感染細胞，12 h后收取細胞樣品，檢測其對FMDV-O復制的調控作用，發現隨著CTSS表達量增加(圖4A、C)，FMDV-O復制水平呈現劑量依賴性降低(圖4B、C)。結果表明，過表達CTSS抑制FMDV-O在PK-15細胞中復制。

A. RT-qPCR檢測CTSS轉錄水平的變化；B. RT-qPCR檢測FMDV-O拷貝數的變化；C. Western blot檢測CTSS和FMDV-O蛋白水平的變化; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001

2.5 CTSS siRNA干擾序列的篩選及其對FMDV-O復制的促進作用

為進一步確定宿主CTSS對FMDV-O復制的影響，針對CTSS設計合成3對特異性siRNA(表1)，將siRNA-2947、siRNA-3629、siRNA-3458分別轉染至PK-15細胞, 在24和36 h分別收取樣品，用RT-qPCR方法選擇干擾效果最好的序列，結果顯示編號siRNA-2947的干擾效果最好(圖5A)。在此試驗結果基礎上，PK-15細胞轉染siRNA-2947，以NC siRNA為對照，36 h后用等量FMDV-O(MOI=1)感染細胞，12 h后收取細胞樣品，用RT-qPCR和Western blot檢測siRNA-2947對FMDV復制的影響，結果表明siRNA-2947能下調宿主CTSS的表達進而促進FMDV-O在PK-15細胞中復制(圖5B、C)。

表1 干擾序列信息

A. RT-qPCR檢測CTSS轉錄水平的變化；B. RT-qPCR檢測FMDV-O拷貝數的變化；C. Western blot檢測CTSS和FMDV-O蛋白水平的變化; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001

2.6 過表達CTSS促進FMDV-O誘導的宿主抗病毒細胞因子產生

為明確豬源CTSS抑制FMDV-O復制的原因，檢測宿主CTSS是否影響由FMDV-O感染誘導的抗病毒細胞因子產生。在PK-15細胞中分別轉染CTSS和pcDNA3.1，24 h后感染FMDV-O(MOI=1)，并設無FMDV-O感染對照組，12 h后收集細胞處理樣品。RT-qPCR結果顯示，CTSS可促進FMDV誘導的IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-4的mRNA水平,說明宿主CTSS能激活FMDV-O誘導的宿主抗病毒細胞因子產生。

*.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001

3 討 論

CTSS是一種溶酶體蛋白酶，主要在抗原呈遞細胞中表達，其活性調節對于MHC-Ⅱ信號傳導及CD4+T細胞介導的免疫反應激活非常重要[27]。有研究報道CTSS活性可以由腸道菌群調節，共生體觸發生理性CTSS活性；病原體引起病理性CTSS活性增加，導致T細胞活化和增殖[28]。而本研究發現FMDV-O感染PK-15細胞可上調內源性CTSS的表達并增強CTSS活性。

FMDV以其自身優勢拮抗宿主免疫應答進而達到成功感染宿主的目的，當然其生命周期也受不同宿主因素影響[29-32]。有文獻報道熱休克蛋白DNAJA3與VP1互作并通過自噬/溶酶體途徑降解VP1，從而減弱VP1對IFN-β信號通路的拮抗作用，最終抑制FMDV復制[30]。本研究發現FMDV-O感染PK-15細胞可上調內源性CTSS的表達并增強CTSS活性，過表達CTSS抑制FMDV-O在PK-15細胞中復制，而下調內源性CTSS能促進FMDV-O復制。有報道稱CTSS能使CX3CL1與CX3CR1相互作用，將免疫細胞募集到炎癥部位增加CX3CL1脫落進入間質，從而改變自身免疫性淚腺炎和淚腺分泌[33]；干燥綜合征患者淚液中CTSS活性升高可誘導促炎細胞因子產生[34]；缺乏CTSS會增加高血壓小鼠線粒體的受損并提高ROS水平和NF-κB活性，從而調節心臟炎癥和纖維化[35]。筆者隨后檢測了CTSS對抗病毒細胞因子mRNA水平的影響，RT-qPCR結果顯示CTSS可促進FMDV-O誘導的IL-6、IL-10、IL-4、IFN-α、IFN-β、IFN-γ基因的轉錄。這一結果與文獻報道一致，提示CTSS可能參與炎癥反應。天然殺傷細胞(NKT)可募集并激活其他先天免疫細胞，從而調節多種免疫反應，以加劇肝的炎癥反應，但CTSB和CTSS抑制劑可降低LPS誘導的炎癥過程中NKT細胞的活化[36]，進一步說明CTSS可能與炎癥有關。FMDV在進化過程中獲得了許多逃避宿主免疫系統的策略[37], 例如FMDV 3A通過破壞RIG-Ⅰ、MDA5和VISA蛋白的表達而抑制病毒觸發的IFN-β信號通路[12]；FMDV VP3降解JAK1以抑制IFN-γ信號轉導途徑[38]； LPro可以抑制天然免疫下游抗病毒細胞因子的產生從而促進病毒的復制[39-41]，本文雖然檢測了抗病毒細胞因子的變化，但機體的免疫系統是一個錯綜復雜的網絡，宿主除了通過調控干擾素信號通路發揮抗病毒功能；還可以通過自噬和凋亡途徑影響病毒復制，比如PCBP2和FMDV VP0互作可以通過凋亡途徑促進FMDV復制[42]。這說明CTSS促進FMDV-O誘導的抗病毒細胞因子的產生，可能是宿主CTSS抑制FMDV-O復制的原因之一，具體詳細機制還需要進一步研究。

本研究首次證實了CTSS在FMDV-O感染過程中發揮抗病毒作用的新功能，為宿主 CTSS拮抗FMDV-O感染方面的研究提供了理論依據，也為下一步探究豬源CTSS在FMDV-O觸發的免疫應答中的作用積累了素材；此外，本研究結果也提示CTSS可能作為抑制FMDV-O復制的潛在靶點發揮作用。

4 結 論

FMDV-O感染與宿主CTSS之間具有相互調控作用，FMDV-O感染PK-15細胞顯著上調內源CTSS表達并增強CTSS酶活性；過表達CTSS能抑制FMDV-O在PK-15細胞中復制，利用特異性siRNA干擾CTSS表達可以促進FMDV-O復制，并且 CTSS能促進FMDV-O誘導的IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-4細胞因子上調表達，明確了CTSS抑制FMDV-O復制的初步原因，具體機制將是下一步研究的方向和重點。