白皮杉醇對氧化應激斷奶仔豬空腸抗氧化能力、黏膜形態和屏障功能的影響

賈沛璐，張 昊，陳亞楠，季書立，王 恬

(南京農業大學動物科技學院，南京 210095)

生物體在進行以氧氣為基礎的能量代謝過程中，涉及多種復雜的氧化還原反應，故不可避免地產生多種活性氧(reactive oxygen species, ROS)。若ROS未被及時清除，會攻擊細胞脂質、DNA和蛋白質等大分子物質，引發過氧化損傷并產生氧化應激[1]。在正常動物體內，ROS的產生和清除處于一種動態平衡的狀態，機體通過抗氧化系統，產生能夠清除ROS的物質和酶，以保證機體不受ROS的影響[2]。然而，當動物外界環境發生變化或者機體抗氧化系統尚未發育完全的時候，機體不能夠及時有效清除ROS，導致過量ROS積聚，從而發生氧化應激[3]。空腸作為機體從外界環境吸收營養物質、溝通內外環境的器官，易受內外環境的影響而產生氧化應激，從而出現形態結構異常、屏障功能損傷、消化吸收功能受損等現象[4]。因此，研究氧化應激對腸道的影響變得尤為重要。敵草快(DQ)是一種常用的氧化應激誘導劑，其能在動物體內迅速產生大量ROS并引發氧化應激[5-6]，而斷奶仔豬易發生斷奶應激導致腸道損傷，進而加劇氧化應激程度。白皮杉醇(PIC)作為一種植物源天然抗氧化劑，因其顯著的抗氧化生物活性而受到廣泛關注。研究表明，PIC能夠增強抗氧化酶活性，上調抗氧化基因的表達，從而緩解氧化應激損傷[7-8]，Yang等[9]研究表明，PIC能降低由脂肪變性導致的氧化應激Hep-G2細胞內的ROS含量，Hao等[10]則發現，PIC通過促進Nrf2核移位增強人視網膜上皮色素細胞的抗氧化能力，而Zhu等[11]研究表明，PIC通過降低人角質形成細胞的氧化應激水平抑制了細胞的異常增殖。然而，目前關于PIC抗氧化活性的研究多集中于細胞水平，在動物機體水平的研究還鮮有報道。

本試驗使用DQ誘導斷奶仔豬發生氧化應激，建立氧化應激的腸道損傷模型，并通過灌喂PIC來探究其對斷奶仔豬空腸抗氧化酶活性、抗氧化相關基因表達以及腸道形態結構和屏障功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選取體重相近的28日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬共54頭，其平均體重為(8.13±0.41) kg，隨機分為3個處理組(每組6個重復，每個重復3頭豬)：對照組(CON)灌喂0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液(Sigma-Aldrich, 美國)并在屠宰前24 h注射生理鹽水，敵草快組(DQ-CON)灌喂0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液并在屠宰前24 h注射DQ(10 mg·kg-1，Sigma-Aldrich, 美國)，敵草快+白皮杉醇組(DQ-PIC)灌喂含有PIC(80 mg·kg-1，杭州瑞樹生物科技有限公司，杭州)的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液并在屠宰前24 h注射DQ。本試驗中，10 mg·kg-1DQ的注射劑量參考Cao等[12]的方法。目前，尚無PIC在斷奶仔豬上的研究報道，故本試驗參考了PIC母體化合物——白藜蘆醇的應用劑量，即80 mg·kg-1[13-15]。PIC是一種白藜蘆醇衍生物，與白藜蘆醇具有相似的化學結構和生物活性，且同屬于植物源多酚活性物質[16]。因此認為，白藜蘆醇在斷奶仔豬上的最適劑量對于PIC而言具有重要的參考價值。所有組別的仔豬均飼喂基礎日糧，自由采食，充足飲水。基礎日糧組成及營養水平見表1。

表1 日糧的組成和營養水平

(續表1)

1.2 樣本采集

在36日齡時，從每頭仔豬的前腔靜脈采集血液，并在4 ℃下以4 000 r·min-1離心10 min，收集血清。所有仔豬被電擊致暈，然后采用頸動脈放血的方法進行處死后迅速剖開腹腔，分離出腸道，并從空腸中段部分截取長度約為1 cm的腸段，然后用無菌生理鹽水沖洗，并立即放入4%多聚甲醛緩沖液中進行固定，以進行后續的形態分析。縱向切開相鄰的腸段后，小心地刮下空腸黏膜并裝入冷凍保存管，迅速放入-80 ℃的液氮中保存待進一步分析。

1.3 空腸的形態學分析

將空腸樣品在4%多聚甲醛中固定24 h后，使用梯度濃度乙醇對其進行脫水，然后包埋在石蠟中。用切片機將包埋有樣品的石蠟塊切成5 μm厚的切片，并在42 ℃下烘烤8 h，然后用蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)進行染色。最后使用倒置顯微鏡(日本Nikon公司，型號為ECLIPSE 80i)對經過以上處理后的切片進行觀察和分析。使用Image-Pro Plus軟件(美國Media Cybernetics公司，版本為Windows 6.0)對切片的空腸絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)進行測量，每張切片隨機選取至少10個視野。

1.4 空腸抗氧化能力測定

將大約300 mg的空腸黏膜冷凍樣品與生理鹽水按照1∶4(質量∶體積)的比例進行混合，然后使用高速勻漿機勻漿制成勻漿液。將勻漿液于4 ℃下4 000 r·min-1離心10 min后，提取上清液進行分析。上清液中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)的活性，以及總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量的測定均使用相應的商業試劑盒(南京建成生物科技研究所, 南京)按照對應的說明書進行測定。

1.5 空腸mRNA的提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)

使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific， 美國)對空腸黏膜組織中的總mRNA進行提取，并對mRNA的濃度和純度進行檢測。使用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，大連)對總mRNA 進行反轉錄，然后使用SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒(TaKaRa，大連)和熒光定量聚合酶鏈反應儀(Applied Biosystems，美國)進行體系為20 μL的qRT-PCR反應：上、下游引物各0.4 μL、10 μL SYBR Premix Ex Taq、6.8 μL超純水、2 μL cDNA模板和0.4 μL ROX Reference Dye。反應過程：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，40個循環；60 ℃ 30 s。以β-actin作為內參基因，2-△△Ct法計算目標基因的相對表達豐度，試驗中使用的引物序列見表2。

表2 本試驗中使用的引物序列

1.6 數據分析

使用Excel 2013對試驗數據進行初步整理，并用“平均值±標準誤(SE)”來表示。使用SPSS 20.0對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并使用Tukey 法進行組間比較以檢驗組間差異性，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 PIC對氧化應激斷奶仔豬空腸絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)的影響

由表3可知，DQ-CON組仔豬的空腸VH和VH/CD均顯著低于CON組(P<0.05)。而DQ-PIC組仔豬空腸的VH/CD顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。各組之間的空腸CD均沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 PIC對氧化應激斷奶仔豬空腸屏障和形態結構的影響

與CON組仔豬相比，DQ-CON組仔豬血漿DAO含量顯著升高(P<0.05)，且空腸OCLN表達量顯著下調(P<0.05)；而DQ-PIC組仔豬的血漿DAO含量則顯著低于DQ-CON組(P<0.05)，同時其空腸OCLN表達量顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。

2.2 PIC對氧化應激斷奶仔豬空腸黏膜抗氧化能力的影響

由表4可知，DQ-CON組的T-SOD活性、GPx活性和CAT活性均顯著低于CON組(P<0.05)，而DQ-PIC組中的上述酶活性均顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。同樣地，DQ-CON組的T-AOC顯著低于CON組(P<0.05)，而DQ-PIC組的T-AOC則顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。DQ-CON組的MDA含量顯著高于CON組(P<0.05)，而DQ-PIC組顯著低于DQ-CON組(P<0.05)。

表4 PIC對氧化應激斷奶仔豬空腸黏膜的抗氧化酶活性的影響

為了進一步探究PIC對氧化應激斷奶仔豬空腸抗氧化能力在RNA水平上的影響，本研究測定了空腸抗氧化相關基因的相對表達豐度，結果見表5。DQ-PIC組NQO1基因的相對表達豐度顯著高于DQ-CON和CON組(P<0.05)，而DQ-CON組與CON組之間則沒有顯著差異(P>0.05)。DQ-CON組SOD1基因的相對表達豐度顯著低于CON組(P<0.05)，而DQ-PIC組則顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。DQ-CON組HO1基因的相對表達豐度顯著高于CON組(P<0.05)，而 DQ-PIC組顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。DQ-CON組SOD2和GPx1基因的相對表達豐度顯著低于CON組(P<0.05)，而DQ-PIC組和DQ-CON組相比沒有顯著差異(P>0.05)。

表5 PIC對氧化應激斷奶仔豬空腸黏膜抗氧化相關基因相對豐度的影響

3 討 論

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內的天然大分子化合物，因其豐富的來源和多樣化的生物活性，近年來逐漸成為研究熱點。PIC是一種具有良好抗氧化活性的天然植物多酚，存在于葡萄、甘蔗及大黃蘚等多種植物中。PIC分子結構中的兩個酚羥基和一個碳碳雙鍵具有強還原性，可迅速清除細胞和組織中的ROS，降低氧化應激的發生風險[17-18]。DQ是一種常見的接觸聯吡啶基除草劑[19]，能夠利用分子氧產生超氧陰離子自由基，并與其他ROS共同誘導細胞線粒體損傷[20-22]。受損的線粒體會釋放更多的ROS，繼而引起機體氧化應激[23-25]。因此，DQ常用于建立嚙齒動物與仔豬等動物氧化應激模型[26-28]。

在本試驗中，DQ的注射引起了DQ-CON組斷奶仔豬血清DAO含量顯著升高，并且該組的空腸黏膜形態也受到了破壞，表現為絨毛高度和VH/CD的顯著降低。小腸作為吸收營養物質的重要器官，其形態結構是動物機體進行正常生長發育的基礎，而小腸絨毛高度，隱窩深度以及VH/CD則是衡量腸道形態結構的重要指標[29]。小腸絨毛上皮細胞負責吸收消化道內的氨基酸、無機鹽、葡萄糖等營養物質，且絨毛高度與吸收能力成正相關，而VH/CD則綜合反映了小腸形態結構的狀態。同時，注射DQ后，DQ-CON組仔豬空腸黏膜中MDA含量顯著升高，T-SOD、GPx和CAT等抗氧化酶的活性均受到了抑制。宋小珍等[30]研究發現，仔豬小腸上皮在氧化應激狀態下產生大量的ROS，進而破壞體內抗氧化系統，導致抗氧化酶活的降低。王遠孝等[31]研究則表明，氧化應激狀態下仔豬小腸黏膜MDA含量上升，T-AOC下降。以上研究結果與本試驗相似，而Maeda 等[32]研究也指出，腸道氧化應激會導致小腸細胞通透性增加以及形態結構受損，這表示，DQ使斷奶仔豬空腸發生了氧化應激，降低了空腸抗氧化能力，從而導致了空腸黏膜形態結構受損，也表明了本試驗中斷奶仔豬氧化應激模型的成功建立。

PIC在本試驗中顯示出了促進腸道形態結構和屏障功能修復作用。本試驗結果顯示，PIC使氧化應激斷奶仔豬空腸絨毛高度增加且VH/CD增加，這反映PIC促進了腸道形態結構的修復。屏障功能是小腸上皮細胞另一項重要功能，而緊密連接則是構成上皮細胞屏障功能的最主要結構，由OCLN等結構蛋白組成[33]。OCLN蛋白與細胞間通透性和移動性有關，其缺失會導致腸上皮細胞通透性增加，進而導致腸道屏障功能受損[34]。在本試驗中，PIC促進了氧化應激仔豬空腸黏膜中OCLN蛋白的mRNA表達量，提示其促進了腸道屏障功能的恢復。而PIC對于空腸形態結構和屏障功能的修復作用可能是通過緩解腸道氧化應激來實現的。

PIC在本試驗中顯示出了緩解腸道氧化應激損傷的作用。作為天然的抗氧化劑，PIC能夠有效地清除各種自由基。已有研究表明，PIC能高效地清除過氧化自由基[16,33]，而李曉霞等[35]則報道，PIC具有較強的清除羥自由基的生物活性，這可能與PIC分子結構中的4個酚羥基有關。PIC也可以刺激動物機體抗氧化系統，提高抗氧化水平，從而降低氧化應激損傷。本試驗結果顯示，PIC使斷奶仔豬空腸黏膜中T-SOD、GPx和CAT的酶活升高，并且上調了NQO1、SOD1和HO1的基因相對表達量，進而降低了MDA的含量，緩解了氧化應激損傷。SOD是一類重要的解毒酶，包括SOD1和SOD2，它們存在于所有能夠進行氧化還原過程的生物中，以谷胱甘肽(GSH)作為反應底物，與GPx和CAT一起清除機體產生的ROS[36-37]。MDA是自由基直接進攻生物膜脂質部分而產生的一種脂質過氧化物，也是反應機體氧化應激程度的一項重要指標[38]。Zhang等[39]發現，PIC能顯著降低老年大鼠海馬皮質組織中的MDA含量，增加SOD和CAT的酶活。Lu等[8]的研究結果顯示，PIC能夠促進Nrf2的核移位，進而上調其下游HO1和NQO1抗氧化基因的表達，提高ARPE-19細胞的抗氧化能力。Jeong等[40]則發現，PIC發揮其抗氧化作用是通過促進HO1基因的表達來實現的，沉默HO1基因以后，PIC的抗氧化作用就消失了。以上研究結果均與本試驗結果相似，PIC提高了抗氧化酶活，上調了抗氧化相關基因的表達，從而降低了MDA含量，緩解了氧化應激損傷。據此推測，PIC在生物體內的抗氧化作用一方面通過直接清除自由基來完成，另一方面則是借助Nrf2/HO1抗氧化信號通路刺激細胞或生物體的抗氧化系統來完成，但其具體機制還有待進一步探究。

4 結 論

本研究中，腹腔注射10 mg·kg-1DQ成功引起了斷奶仔豬空腸氧化損傷，進而影響了空腸黏膜形態和屏障功能。而斷奶仔豬灌喂80 mg·kg-1PIC能夠有效緩解敵草快誘導的空腸氧化損傷，改善黏膜形態，促進屏障功能的恢復。