前列腺素D2與F2α對綿羊黃體退化的影響及其機理研究

楊 恒，邵焱焱，趙宗勝*，朱夢婷, 3，南 穎，王明遠，方晨輝，吳 培，謝夢婷，江白慧

(1. 西南大學動物醫學院，重慶 402460； 2. 石河子大學動物科技學院，石河子 832000；3.新疆農墾科學院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，石河子 832000)

黃體(corpus luteum，CL)是母畜卵巢在生殖生理過程中的一個內分泌腺體，是建立和維持妊娠必需的內分泌器官[1]。在正常繁殖周期內，如果卵子受精，CL將分泌孕酮等來參與調節受精卵著床、胚胎發育及妊娠維持[2]。如果卵子未受精或處于妊娠末期(或分娩后)，CL將會正常退化成為啟動下一個生殖周期的前提[3]。因此，CL退化在哺乳動物的生殖周期中起著重要的“關卡”作用，對于重啟母畜生殖功能的周期性變化具有重要的意義。

前列腺素(prostaglandins，PGs)是一組內源性的酸性脂質，廣泛分布于哺乳動物體內，涉及大量的生殖過程[4-5]。大多數內源性PGs由花生四烯酸代謝衍生而來，當花生四烯酸通過磷脂酶A2從質膜釋放時，環氧合酶(COX或PTGS)1和2會將花生四烯酸轉化為PGH2；在特定酶的作用下，PGH2被選擇性轉化為相應的PGs，包括PGF2α、PGE2、PGD2、PGI2和TXA2[6-7]。其中，PGF2α被認為是母畜CL退化的主效溶解素，而PGE2則被認為是CL維持的重要保護介質[4,8]。通常在妊娠期間PGE2分泌水平較高，能夠競爭性抑制PGH2向PGF2α的合成轉化，從而降低PGF2α濃度，利于CL維持和胎兒發育；但在分娩啟動后，隨著胎兒保護機制的消失，CL維持則轉而退化，PGE2合成下降，PGH2向PGF2α合成增加，從而促使產后或者空懷母體完成功能性(主要表現為P4下降)及結構性(主要表現為內皮細胞失去緊密的連接，黃體體積減少、完整性被破壞)的CL退化進程[9-10]，繼而開啟新的生殖周期。但是，與PGs家族其他成員(如PGF2α、PGE1和PGE2)不同的是，PGD2在繁殖方面的相關調控作用并未引起人們足夠的重視，其有關研究更是鮮有報道。

目前，大量研究證實，前列腺素家族的作用機制并不是某一種單一PGs成員的效應，而是多個PGs家族成員通過其相應受體的結合而共同發揮作用[11-12]，因此，在子宮或卵巢黃體組織中不同的PGs成員之間可能會發生不同程度的協同作用或競爭性地拮抗效應。本研究選取哈薩克母羊為研究對象，探究PGD2與PGF2α在母體CL退化過程中可能存在的作用機制，為進一步優化母畜高效繁育技術、保障畜牧業的連續繁育生產提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養管理

2020年5月份選擇購置同一個養殖場16只健康的哈薩克母羊(年齡3～4歲，體重47 kg左右，無繁殖疾病且發情周期正常)，將試驗羊群飼養于石河子大學動物科技學院試驗站。欄內散養，每天早上和下午飼喂，自主采食苜蓿干草，配置舔磚(防應激)，自由飲水、自然光照，保證羊欄里干凈無雜物、管理及環境條件一致。待其飼養14 d適應圈舍環境后，再進行試驗。

1.2 主要試劑

PGD2與PGF2α兔源多克隆抗體，山羊抗兔IgG二抗均購自Abcam公司；PGF2α購自Macklin公司；綿羊孕酮(PROG)、雌激素(E2)、前列腺素F2α(PGF2α)和D2(PGD2)ELISA Kit均購自晶美生物工程有限公司；HE染色試劑盒、總RNA提取試劑盒、總蛋白提取試劑盒、SCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 試劑盒均購自Solarbio公司；HiFiScript cDNA Synthesis Kit購自北京康為世紀有限公司；TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)購自TaKaRa公司；蛋白Marker購自博奧森生物公司；PVDF膜購自ThermoFisher Scientific公司；ECL顯色劑購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 子宮肌內注射處理 采用陰道埋孕酮栓和肌內注射氯前列腺烯醇法使母羊同期發情。為消除同期發情對試驗的影響，待其同期發情處理第2個發情周期的黃體期(前期課題組已對同一批40只哈薩克母羊進行了2個發情周期的觀察，發現哈薩克母羊群體中發情行為呈現較為明顯的周期性變化，其發情周期為18 d左右，發情持續時間為24～48 h，為本試驗選擇黃體期中期即發情周期第11天進行子宮肌內注射處理提供了保障)進行試驗分組處理，采用微創手術在有中期黃體的一側子宮小彎處進行肌內注射藥物，并將試驗分為4組，即分別為PGD2組(1 mg·mL-1，0.2 mL)、PGF2α組(1 mg·mL-1，0.2 mL)、 PGD2+PGF2α組(1 mg·mL-1，各0.2 mL)及生理鹽水(0.2 mL，對照組)，每組4個重復。

1.3.2 HE染色 子宮肌內注射48 h后(避免此時黃體組織發生生理性周期性退化)進行屠宰，立即采集子宮、卵巢(黃體)組織于-80 ℃保存、備用。采集的黃體用4%多聚甲醛直接固定，待包埋切片后，利用蘇木素-伊紅(HE)染色，直接觀察黃體組織形態。

1.3.3 血液采集、處理與激素測定 子宮肌內注射處理到屠宰間隔48 h，每隔6 h(0、6、12、18、24、30、36、42和48 h)采集一次靜脈血，每次5 mL，4 000 r·min-1離心10 min，分離血清后，做好標記保存于-20 ℃備用。利用酶聯免疫測定(ELISA)試劑盒檢測血清中的P4、E2、PGD2及PGF2α濃度，分析不同處理組中上述激素在體內的濃度變化。

1.3.4 qRT-PCR測定 參照總RNA提取試劑盒說明書提取子宮、黃體組織中總RNA，使用Nanodrop2000檢測RNA的純度及濃度。按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書反轉錄成cDNA，使用Nanodrop2000檢測cDNA的純度及濃度，保存于-20 ℃。qRT-PCR檢測7個引物(表1)，由Sangon Biotech公司合成。按照TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書操作實施qRT-PCR檢測：TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)0.8 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，滅菌水6 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性30 s；2. 55個循環：95 ℃ 5 s，56 ℃ 30～34 s。

表1 引物序列信息

1.3.5 Western blot測定 不同組別的子宮、卵巢(黃體)組織置于液氮中研磨后，將碾碎的組織放入蛋白裂解液中裂解，離心后，提取總蛋白，并利用SCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度；各組提取等量蛋白后，加入5×蛋白上樣緩沖液，高溫變性；再制備12%分離膠和5%濃縮膠，加入樣品和蛋白Marker進行SDS-PAGE，并將目的蛋白切膠轉移至 PVDF 膜上，置于搖床室溫清洗封閉，取出PVDF膜加入一抗，4 ℃搖床、孵育過夜；最后，PBST搖床洗滌，加入二抗，室溫搖床孵育，再添加ECL顯色劑對蛋白條帶進行照相分析。

1.4 統計分析

實時熒光定量數據以2-ΔΔCt法處理，Western blot蛋白結果使用Image J軟件分析灰度值，使用SPSS Statistics 19軟件ANOVA比較基因、蛋白表達量差異，P<0.05被認為具有統計學意義。

2 結 果

2.1 處理前后黃體組織形態學觀察

HE染色結合物理拍照對比不同組別處理前后黃體形態變化，結果如圖1所示，各組之間的黃體組織結構形態均發生了不同程度的變化：1)PGD2組中，黃體體積未發生顯著變化，但卵巢組織中出現多個卵泡，HE染色發現，黃體結構已發生空腔化并伴有CL結構退化的初期特征；2)PGF2α組中，黃體體積明顯縮小，卵巢組織中出現單個較大卵泡，HE染色結果顯示，黃體組織已發生顯著結構性退化；3)與 前兩組相比，PGD2+PGF2α組中，黃體體積縮小更為明顯，同時，卵巢組織中出現多個較大卵泡，HE染色發現，黃體組織已基本退化完成，并出現多個活性卵泡；4)對照組中，黃體體積未發生明顯變化，同時卵巢組織呈現靜止狀態(無活性卵泡)，HE染色結果顯示，黃體組織結構完整，并未發生CL退化現象。

A. PGD2組；B. PGF2α組；C. PGD2+PGF2α組；D. 對照組；黑細箭頭指示黃體結構，黑粗箭頭指示卵泡

2.2 不同組別中激素水平的變化

2.2.1 不同組別P4水平的變化 使用ELISA法檢測血清中P4水平，結果如圖2所示。PGD2組P4濃度隨時間變化呈顯著下降趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為-0.212 5，在PGD2處理后24 h出現明顯的單峰，峰值為8.65 ng·mL-1；PGF2α組P4濃度隨時間變化呈顯著下降趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為-0.222 1，在PGF2α處理后30 h出現明顯的單峰，峰值為8.37 ng·mL-1；PGD2+PGF2α組中P4濃度隨時間變化呈顯著下降趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為-0.349，在PGD2結合PGF2α處理后6和36 h出現明顯的雙峰，峰值分別為10.69和8.70 ng·mL-1； 對照組中P4濃度隨時間變化不顯著(P>0.05)，趨勢線斜率為0.021 5，在生理鹽水處理后24 h出現不明顯波動性變化。此外，通過組間P4激素變化趨勢對比分析，發現對照組與上述3個試驗組之間均存在極顯著性差異(P<0.01)。

A. PGD2組；B. PGF2α組；C. PGD2+PGF2α組；D. 對照組。下同

2.2.2 不同組別E2水平的變化 結果如圖3所示，PGD2組E2濃度隨時間變化呈顯著下降趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為-0.953 9，在PGD2處理后24 h 出現不明顯的單峰，峰值為211.35 pg·mL-1；PGF2α組E2濃度隨時間變化呈顯著上升趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為4.538 3，在PGF2α處理后12和36 h出現明顯的雙峰，峰值分別為252.44和282.26 pg·mL-1；PGD2+PGF2α組中E2濃度隨時間變化呈顯著上升趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為0.527 7，但在PGD2結合PGF2α處理后18 h出現明顯的單峰，峰值為274.82 pg·mL-1；對照組中E2濃度隨時間變化呈顯著下降趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為-1.556 3，處理后48 h內未出現明顯的波動性變化。此外，通過組間E2激素變化趨勢對比分析，發現對照組與上述3個試驗組之間均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖3 各組母羊血清中E2濃度變化

2.2.3 不同組別PGD2水平的變化 結果如圖4所示，PGD2組PGD2濃度隨時間變化呈顯著上升趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為2.576 1，在PGD2處理后24和36 h出現明顯的雙峰，峰值為77.78和101.94 pg·mL-1；PGF2α組PGD2濃度隨時間變化呈顯著下降趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為-1.240 4，在PGF2α處理后6 h出現明顯的單峰，峰值為83.82 pg·mL-1；PGD2+PGF2α組中PGD2濃度隨時間變化呈顯著下降趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為-0.841 3，在PGD2結合PGF2α處理后6和24 h出現不明顯的雙峰，峰值分別為92.34和92.38 pg·mL-1；對照組中PGD2濃度隨時間變化呈顯著上升趨勢(P<0.05)， 趨勢線斜率為1.204 5，處理后48 h內未出現明顯的峰值。此外，通過組間PGD2激素變化趨勢對比分析，發現對照組與上述3個試驗組之間均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖4 各組母羊血清中PGD2濃度變化

2.2.4 不同組別PGF2α水平的變化 結果如圖5所示，PGD2組PGF2α濃度隨時間變化呈不顯著下降趨勢(P>0.05)，趨勢線斜率為-0.000 8，在PGD2處理后24 h出現明顯的單峰，峰值為33.50 pg·mL-1；PGF2α組PGF2α濃度隨時間變化呈不顯著上升趨勢(P>0.05)，趨勢線斜率為0.046，在PGF2α處理后6和18 h出現明顯的雙峰，峰值為34.07和33.03 pg·mL-1；PGD2+PGF2α組中PGF2α濃度隨時間變化呈顯著下降趨勢(P<0.05)，趨勢線斜率為-0.456 4，在PGD2結合PGF2α處理后18 h出現明顯單峰、峰值為34.79 pg·mL-1，36 h出現明顯谷峰，谷值為24.95 pg·mL-1；對照組PGF2α濃度隨時間變化呈不顯著上升趨勢(P>0.05)，趨勢線斜率為0.026 2，在處理后24 h出現明顯的谷峰，谷值為24.42 pg·mL-1。此外，通過組間PGF2α激素變化趨勢對比分析，發現對照組與上述3個試驗組之間均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖5 各組母羊血清中PGF2α濃度變化

2.3 不同方案處理前后PGs關鍵合成酶表達量

不同方案處理后48 h分別提取總RNA和蛋白，進行qRT-PCR和Western blot檢測子宮端PGs的關鍵合成酶表達水平。結果如圖6所示，與對照組相比，PGD2組HPGDS mRNA和蛋白表達量顯著上調(P<0.05)，PGF2α組和PGD2+PGF2α組HPGDS mRNA和蛋白表達量顯著下調(P<0.05)；而PGFS mRNA和蛋白表達量在上述3個試驗組中均呈顯著性上調表達(P<0.05)。

圖6 PGD2和 PGF2α關鍵合成酶mRNA(A)和蛋白相對表達量(B和C)

2.4 不同方案處理前后PGs受體表達量

不同方案處理后48 h分別提取總RNA和蛋白，qRT-PCR和Western blot檢測黃體端PGs的受體表達水平。結果如圖7所示，與對照組相比，PGD2組、PGF2α組中DP1 mRNA和蛋白表達量顯著上調(P<0.05)，PGD2+PGF2α組中DP1 mRNA和蛋白表達量呈不顯著上調(P>0.05)；類似地，PGF2α組、PGD2+PGF2α組中CRTH2 mRNA和蛋白表達量顯著上調(P<0.05)，PGD2組中CRTH2 mRNA和蛋白表達量呈不顯著上調(P>0.05)；而FP mRNA和蛋白表達量在上述3個試驗組中均呈顯著性上調表達(P<0.05)。同時，通過組間的數據對比發現，PGD2單獨使用對DP1受體的影響呈最大促進效應，PGF2α單獨使用時，對CRTH2受體的影響呈最大促進效應，PGD2+PGF2α結合使用時，對FP受體的影響呈最大促進效應。此外，PGD2兩種類型受體的表達中，發現PGD2組中DP1表達量顯著高于CRTH2(P<0.05)，而PGF2α組中CRTH2表達量顯著高于DP1(P<0.05)。

圖7 PGD2和PGF2α不同受體mRNA(A)和蛋白(B和C)相對表達量變化

3 討 論

CL是哺乳動物卵泡排空后形成的一個暫時的內分泌腺體，是建立和維持妊娠的必需內分泌器官。正常繁殖周期中，哺乳動物的CL必須有規律地退化，才能保證生殖活動的正常進行。目前，普遍認為PGF2α是引起CL退化關鍵因素[9,13]，PGE2是CL維持的重要保護介質[11,14]。妊娠CL維持期間，PGE2合成酶會競爭性抑制PGH2向PGF2α的合成轉化，降低體內PGF2α濃度，利于CL維持[15-16]；但在CL啟動退化機制后，PGE2合成的競爭性抑制效應減弱，體內PGF2α的合成增加，從而加速CL退化的進程[17-18]。因此，不難發現，PGF2α和PGE2在CL維持與退化過程中存在競爭性拮抗效應，這為本試驗開展PGD2在CL退化過程中的作用機制研究提供了重要參考。

目前，大量研究顯示，PGs對CL組織的調控取決于每個PGs成員之間形成的疊加效應[12,15-17]。本研究通過HE染色結合物理拍照對比不同方案處理前后CL組織形態學變化，發現PGD2與PGF2α對母羊CL組織的作用效應一致，均能夠促進CL組織的退化；但其效果呈現明顯的差異，即PGF2α組>PGD2組，說明單獨使用PGD2時并不能夠有效的促進CL的退化。然而，PGD2不同于PGE2，它能夠協同PGF2α共同促進CL的退化，其效果明顯優于前兩者單獨使用的退化效果，這一結論與邵焱焱等[19]在黃體化細胞中分別添加PGD2、PGF2α及PGD2+PGF2α觀察CL細胞退化結論一致，這提示，在CL維持與退化過程中，PGD2與PGF2α之間可能存在協同效應，而不同于PGE2與PGF2α之間的拮抗效應。

CL作為母體合成和釋放孕激素的重要內分泌器官，其結構或功能的改變直接或間接地影響著機體卵巢-子宮軸內分泌功能的變化[20-21]。本研究通過檢測外周血P4分泌水平發現，3個試驗組P4濃度隨時間變化均呈現下降趨勢，其下降程度分別為PGD2+PGF2α組>PGF2α組>PGD2組。這一結果與上述形態學觀察結果一致，提示PGD2與PGF2α單獨使用或聯合使用均能夠引起CL發生功能性退化。但是，由于PGs作用于CL組織存在一定的時效性，導致不同組別中CL功能性退化時間出現差異，效果也不相同[22-24]。本研究發現，PGD2組中P4濃度曲線峰值出現的時間(24 h)，比PGF2α組提前6 h， 這可能是由于PGD2舒張了子宮-卵巢軸血管叢系統(UOP)血管，導致其血流加大、速度加快，使其PGs(內源性PGF2α和外源性PGD2)被迅速轉運至黃體組織而發揮生物學效應[25-26]；但是這種退化機制效應沒有PGF2α強烈。不過，與對照組和上述試驗組相比，PGD2結合PGF2α使用時，P4濃度曲線呈現雙峰狀態，峰值出現在6和36 h，說明二者結合使用能夠更早地啟動CL的功能性退化。P4和E2作為CL組織自分泌或旁分泌的調節劑[27]，在CL退化過程中P4濃度的降低會導致LH搏動性增加，從而加快發育中卵泡的生長速率和E2生成水平[28]。這一結果與本研究中PGD2+PGF2α組和PGF2α組的結果相吻合，即在CL退化機制啟動后，卵巢卵泡的抑制效應被解除，從而導致E2濃度升高[29-30]。但是，值得注意的是，PGD2+PGF2α組中E2濃度曲線單峰最大值出現的時間明顯早于PGF2α組，這與本研究中P4濃度曲線變化趨勢相吻合。但與前者不同，PGD2單獨使用時，E2水平卻呈現明顯下降趨勢，這一現象也與Farhat等[31]發現的PGD2能夠調節卵巢顆粒細胞增殖、促進E2的分泌結果相悖；推測產生這種差異的主要原因，可能是相較于卵泡結構，PGD2更傾向于優先靶向CL組織，以參與其維持與退化過程的調節；但其具體機制仍有待于進一步研究。

CL退化過程中，不同PGs家族成員之間既相互制約、又相互促進。本研究通過ELISA法檢測外周血液PGD2和PGF2α濃度發現，在PGD2組中，PGD2在處理后24和36 h出現明顯的雙峰，而PGF2α濃度則僅在處理后24 h出現一個明顯的單峰，提示在24 h出現的CL功能性退化很可能是由于“外源PGD2+內源性PGF2α”分泌的短暫增加所致[32-33]。但與前者不同，PGF2α單獨使用或聯合PGD2使用時，發現PGD2濃度呈現下降趨勢，說明在此時PGF2α能夠抑制內源性PGD2的生成，從而導致體內PGD2濃度下降[34]。與PGD2類似，在本研究中PGD2+PGF2α組中PGF2α濃度也呈下降趨勢；但產生這一下降趨勢的原因與PGD2不同，在PGD2+PGF2α組中很可能是由于超生理濃度的PGD2較大程度地舒張了UOP血管[25-26]，導致大部分外源和內源性PGF2α能夠及時地被轉運至CL組織發揮生物學效應而產生損失。這一趨勢結果與HE觀察結果相一致，說明當PGD2和PGF2α聯合使用時，PGD2很可能發揮著雙重調控作用：即一方面促進內源性PGF2α的產生、延長其衰減時長，另一方面促進UOP血管舒張、增加外源性PGF2α的有效利用，從而呈現了明顯的優于單獨注射PGF2α時CL退化效果。

PGs屬于類二十烷酸的多不飽和脂肪酸的衍生物，它們是由特定的PGs關鍵合酶催化反應產生。其中，PGD2關鍵合成酶是HPGDS，PGF2α關鍵合成酶是PGFS。本研究通過檢測HPGDS和PGFS的表達水平發現，無論是單獨使用還是結合注射外源性PGF2α，子宮端HPGDS的表達均呈顯著性下調，提示當體內PGF2α濃度升高時能夠明顯地抑制其內源性PGD2的合成，從而引起外周PGD2濃度的下降；這一結論與ELISA檢測PGD2的結果相吻合。但與前者不同，PGD2單獨或聯合PGF2α使用時，子宮端PGFS的表達呈顯著性上調，說明當體內PGD2濃度增加時能夠明顯促進其內源性PGF2α的合成，從而導致機體CL退化呈現最大化。造成這一現象的原因很可能與體內E2含量變化有關，即E2處于低水平時，能夠促進PGD2的合成，而當E2水平升高時，則促進PGF2α的合成；Chaud 等[35]、Acosta等[36]和Hayashi[37]的研究也證實了這一觀點。同時，依據不同的受體類型，PGs在靶標組織中發揮著不同的生物學效應。本研究發現，PGD2或PGF2α單獨使用時，主要影響PGD2受體(DP1和CRTH2)的表達，即PGD2促進DP1受體的高表達，而PGF2α則促進CRTH2受體的高表達。但兩者不同的是，當PGD2濃度升高時，PGD2主要是通過結合DP1受體擴張UOP血管[38-39]，以加速內源性PGF2α向CL組織的轉運，促進CL退化；而當PGD2濃度較低時，PGD2則主要是通過結合CRTH2受體開啟CL細胞的凋亡過程[40]，以“外源性PGF2α促進+內源性PGD2啟動凋亡”的機制形式，雙重促進CL退化，這一觀點也在本研究中HE染色與形態學觀察結果中得到驗證。此外，當PGD2結合PGF2α使用時，發現二者對PGF2α受體(FP)的作用呈最大促進效應，且此時DP1和CRTH2受體也均呈較高水平，說明PGD2結合PGF2α使用時之所以能夠表現出最佳的CL退化效果，很可能是開啟了兩種機制：即一是促進主效激素PGF2α的合成與受體的表達，二是提高PGD2受體DP1和CRTH2受體的均衡表達，最終以“PGF2α+PGD2”協同作用于CL退化過程。

4 結 論

本研究發現，PGD2無論單獨使用或結合PGF2α使用，均呈現促進CL退化的效應。但單獨使用時，其促進CL退化效果不明顯，而當其與主效促溶素PGF2α聯合使用時，呈現出最佳的促進CL退化效果，這為全面探析CL退化機制以及進一步優化哺乳動物高效繁殖技術(尤其是PGs方案)提供了新的參考依據。