miR-148a-3p靶向PPARγ基因抑制鵝顆粒細胞孕酮的合成

鄧 艷，解廣娟，胡深強，李 亮，王繼文

(四川農業大學 畜禽遺傳資源發掘與創新利用四川省重點實驗室，成都 613111)

microRNAs(miRNAs)是一類由約22個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA分子，其通過自身種子序列與靶基因特定位點進行堿基配對結合[1-2]，廣泛參與動物卵巢類固醇激素合成與分泌的調控過程[3-5]。

近年來，大量研究已報道，miRNAs能調節卵巢顆粒細胞類固醇激素的生物合成[6-8]。研究發現，miR-15a參與了人卵巢顆粒細胞中黃體酮、雄激素和雌激素的釋放，并且在過表達miR-15a后可以促進孕酮和睪酮生成[9]。Zhang等[10]發現，在FSH處理后的牛顆粒細胞中，miR-31和miR-143通過靶向FSHR基因抑制孕酮的分泌。在豬顆粒細胞中，miR-378通過靶向芳香化酶的3′UTR來調節卵巢中雌二醇的分泌[4]。而在小鼠顆粒細胞中，miR-383可以靶向RBMS1促進雌二醇的代謝[5]。這些結果表明，miRNAs在哺乳動物卵巢顆粒細胞的類固醇激素合成與分泌方面有重要調控作用。相比miRNAs在哺乳動物中的研究，其在禽類卵巢中的研究大多集中在對卵巢細胞增殖和凋亡的調控。比如，Kang等[11]研究表明，miR-26a-5p通過靶向TNRC6A基因促進雞卵巢卵泡膜細胞的增殖。miR-26b-5p受到轉錄因子SMAD4的調控，靶向INHBB介導TGF-β/SMADs信號通路的表達，從而促進鵝卵泡顆粒細胞的增殖[12]。此外，鵝顆粒細胞的增殖和凋亡也受miR-181a-5p的調控，其通過靶向SIRT1參與FOXO信號通路[13]。然而，miRNAs 對禽類卵泡顆粒細胞的類固醇激素的合成與分泌的調控機制還未見報道。

過氧化物酶體增殖物激活型受體(peroxisome proliferator activated receptors，PPARs)是核受體超家族的配體依賴型轉錄因子，主要包括α、β、γ三種亞型[14-15]。其中，PPARγ參與調節卵巢的卵泡發育、排卵及卵子的質量和類固醇激素(雌激素和孕激素)的分泌[16-17]。Kim等[16]研究表明，PPARγ通過調控孕激素受體參與小鼠顆粒細胞類固醇激素的合成。然而，PPARγ基因是否影響鵝卵巢顆粒細胞的生物學功能目前尚不清楚。

本課題組前期轉錄組測序發現，miR-148a-3p在鵝4～6 mm、8～10 mm和F5卵泡顆粒層中的表達逐漸升高。因此，本研究首先檢測miR-148a-3p在鵝不同階段卵泡顆粒層中的表達，然后在體外培養的鵝卵泡顆粒細胞中通過轉染mimics和inhibitor模擬miR-148a-3p的過表達和抑制，利用qPCR法檢測與類固醇激素合成分泌相關基因的表達變化，接著通過雙熒光素酶報告系統驗證靶標關系，最后干擾靶基因檢測miR-148a-3p對孕酮合成變化的影響，為進一步闡明miR-148a-3p在禽類顆粒細胞中的功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

本試驗共選用12只天府肉鵝母系母鵝，其中，6只 進行組織樣品采集，6只進行顆粒細胞的分離培養。所選用的試驗鵝均由四川農業大學家禽育種場提供，試驗鵝在相同的條件下飼養，開產時間和體重基本一致。鵝麻醉致死后，迅速取出整個卵巢，用游標卡尺測量不同直徑大小的卵泡(2～4 mm、4～6 mm、 6～8 mm、8～10 mm、F5、F4、F3、F2、F1)，根據甘翔等[18]的方法進一步分離不同階段卵泡顆粒層，PBS漂洗3～4次，將顆粒層附著的卵黃清洗干凈后，剪碎并置于-80 ℃凍存，用于RNA提取。

1.2 miR-148a-3p在不同物種中的保守性分析

在miRBase(http://www．Mirbase.org/)數據庫中在線檢索人(Homosapiens, GenBank_No.：NC_000003.12)、小鼠(Musmusculus, GenBank_No.：NC_000072.6)、雞(Gallusgallus, GenBank_No.：NC_006099.5)、豬(Susscrofa, GenBank_No.：NC_010455.5)、牛(BosTaurus, GenBank_No.：NC_037349.1)、恒河猴(Macacamulatta, GenBank_No.：NC_041755.1)、綠蜥蜴(Anoliscarolinensis, GenBank_No.：NC_014777.1)、大西洋鮭魚(Salmosalar, GenBank_No.：NC_027314.1)8個物種的miR-148a-3p成熟體序列，鵝的miR-148a-3p成熟體序列由課題組前期miRNA測序所得，采用MEGA 7進行保守性分析。

1.3 鵝等級卵泡顆粒細胞分離培養與轉染

參考Deng等[19]的方法進行鵝等級卵泡顆粒細胞的體外培養，待細胞匯合度為70%～80%時，根據Lipofectamine?3000(Invitrogen，USA)試劑使用說明，先將lipofectamine 3000分別和miR-148a-3p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC、Control在DMEM/F12(HyClone，USA)培養基內形成脂質體復合物，然后共轉染到顆粒細胞中，在含5% CO2的37 ℃培養箱中培養。轉染后6 h對細胞狀態進行一次觀察，轉染24 h后收取上清液和細胞用于后續的檢測。miR-148a-3p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC由上海吉瑪制藥技術有限公司合成(表1)。

表1 miR-148a-3p mimics和inhibitor合成序列

1.4 鵝卵泡顆粒層組織和顆粒細胞RNA的提取與反轉錄

利用RNAiso Plus(TaKaRa, China)提取鵝卵泡顆粒層組織和細胞的總RNA，利用Nano Drop 2000紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，使用Prime ScripTMRT reagent Kit(TaKaRa, China)進行mRNA反轉錄，按照上海吉瑪制藥技術有限公司的miRNA反轉錄試劑盒反轉錄miRNA，反應結束后置于-20 ℃保存備用。

1.5 qPCR檢測miR-148a-3p及關鍵基因的表達

利用課題組前期對鵝顆粒細胞miRNA測序得到的miR-148a-3p序列，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成miR-148a-3p定量檢測試劑盒，其他mRNAs 定量檢測引物由華大基因科技有限公司合成(表2)。使用SYBR?Premix Ex TaqTM II(TaKaRa, China)檢測mRNAs表達量，mRNAs反應體系為：SYBR?Premix Ex TaqTM II 6.25 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1 μL，無菌水4.25 μL，總反應體系為12.5 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸30 s， 72 ℃ 10 min, 總共40個循環；設置熔解曲線為65～95 ℃，每5 s增加0.5 ℃，以檢測引物特異性。使用miR-148a-3p定量檢測試劑盒檢測miR-148a-3p的表達量，miR-148a-3p的反應體系為：2×Real-time PCR Master Mix (SYBR) 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，TaqDNA polymerase 0.2 μL，模板2 μL，無菌水7 μL， 總反應體系為20 μL。反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 12 s，退火溫度40 s，共40個循環。每個樣本設3個 技術重復，miRNA表達量計算以U6為內參，mRNAs表達量計算以GAPDH和β-actin為內參。

表2 用于qPCR的引物

1.6 突變型載體和野生型載體構建

通過miRecords_version4、miRTarBase、Tarbase 7.0等數據庫中收錄的經試驗驗證的miR-148a-3p靶基因，綜合TragetScan 7.1、miRanda、miRWalk 2.0、DIANA-microT等在線軟件預測的結果發現，PPARγ-3′UTR與miR-148a-3p種子序列存在結合位點(圖1)。根據鵝PPARγ-3′UTR 序列設計含結合位點在內的擴增引物(表3)，將所得到的PPARγ-3′UTR目的片段和pmir GLO空載質粒(Promega，USA)分別用SacⅠ和XbaⅠ進行雙酶切，酶切反應完畢后進行純化回收。將經過切膠純化后的目的片段和已切開的pmir GLO(Promega，USA)空載質粒進行連接，構建野生型靶標驗證載體PGL/PPARγ-WT。將野生型載體的潛在結合位點突變為其互補序列(圖1)，從而得到突變型重組載體即PGL/PPARγ-Mut，突變載體由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。

黑色加粗字體為種子序列和突變序列

表3 PPARγ-3′UTR序列擴增引物

1.7 雙熒光素酶報告試驗驗證miR-148a-3p的靶基因

使用中國倉鼠卵巢細胞系(CHO，中國科學院昆明動物研究所)用于雙熒光素酶報告系統檢測。CHO細胞系復蘇后接種于培養皿中，待細胞長滿后用胰酶消化，然后用含10% FBS(Gibco, USA)的DMEM/F12(HyClone, USA)培養基重懸細胞，以4×106個·mL-1的密度接種于96孔板。待細胞密度達到約60%～70%時，按照Lipofectamine?3000(Invitrogen，USA)說明書將miR-148a-3p mimics分別與PGL/PPARγ-WT或PGL/PPARγ-Mut兩兩進行共轉染，每個處理設置3孔重復。轉染后24 h使用Dual-Luciferase?Reporter試劑盒(Promega, China)檢測細胞熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶作為試驗報告基因，海腎熒光素酶作為對照報告基因，二者的比值即為相對熒光素活性。

1.8 miR-148a-3p靶基因的干擾

從NCBI獲取鵝PPARγ CDS區預測序列，由上海吉瑪制藥技術有限公司構建si-PPARγ，序列見表4。結合Lipofectamine?3000(Invitrogen，USA)試劑使用說明，使用12孔板轉染siRNA及其NC，轉染24 h后收集樣品進行關鍵基因表達量的檢測及激素含量的檢測。

表4 PPARγ干擾序列

1.9 ELISA檢測孕酮含量

細胞轉染24 h后收取細胞上清液，根據ELISA試劑盒(上海恒遠科技有限公司，中國)說明書在板條標準品孔內加50 μL不同濃度標準品，樣本孔加10 μL待測樣本和40 μL稀釋液，空白孔不加，其余孔中加入100 μL辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體，封板膜密封，37 ℃恒溫箱溫育60 min；棄去液體，紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，紙上拍干，重復洗板5次；每孔各加入50 μL底物A、B，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入50 μL終止液混勻，15 min內在450 nm波長處檢測各孔OD值。在Excel中，以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值，從而得到不同處理組中孕酮含量。

1.10 數據的統計與分析

采用SPSS 19.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析，組間差異顯著性檢驗采用獨立樣本t檢驗進行分析，利用公式2-△△Ct計算所選目標基因的相對表達量[20]。P<0.05 表示具有統計學意義，數據用“平均值±標準誤”表示。

2 結 果

2.1 miR-148a-3p在不同物種中的保守性分析

通過miRBase數據庫下載不同物種的miR-148a-3p的成熟體序列，比對不同物種的成熟體序列，結果發現，miR-148a-3p的成熟體序列在各個物種中高度保守，其核心的種子序列基本一致(表5)。

表5 miR-148a-3p序列保守性分析

2.2 miR-148a-3p在鵝不同階段卵泡顆粒層中的表達分析

結果如圖2所示，隨著卵泡直徑的增加，miR-148a-3p的表達量呈現先升高后下降的趨勢，且在等級卵泡F4顆粒層中表達最高。此外，miR-148a-3p在等級階段卵泡顆粒層的表達也高于等級前卵泡(圖2)，因此，選擇等級卵泡顆粒細胞用于后續的細胞試驗。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.3 轉染miR-148a-3p mimics和inhibitor對鵝卵泡顆粒細胞功能的影響

為了探究miR-148a-3p對鵝卵泡顆粒細胞功能的影響，在鵝等級卵泡顆粒細胞中轉染miR-148a-3p mimics和inhibitor。定量結果顯示，與mimics NC組相比，miR-148a-3p mimics能顯著下調3β-HSD表達(圖3A,P<0.05)，而與inhibitor NC組相比，miR-148a-3p inhibitor能顯著上調3β-HSD表達(圖3C,P<0.05)。同時，ELISA結果顯示，與mimics NC組相比，miR-148a-3p mimics能顯著抑制孕酮的合成(圖3B,P<0.05)，而與inhibitor NC組相比，miR-148a-3p inhibitor能顯著促進孕酮的合成(圖3D,P<0.05)。由此可知，miR-148a-3p能抑制鵝等級卵泡顆粒細胞中孕酮的合成。

A. miR-148a-3p mimics對3β-HSD的mRNA表達的影響；B. miR-148a-3p mimics對孕酮合成的影響；C. miR-148a-3p inhibitor對3β-HSD的mRNA表達的影響；D. miR-148a-3p inhibitor對孕酮合成的影響。NC. 陰性對照組；mimics. miR-148a-3p mimics；inhibitor. miR-148a-3p inhibitor；Control. 空白對照組

2.4 miR-148a-3p靶基因的確定

為了進一步探究miR-148a-3p抑制鵝卵泡顆粒細胞孕酮合成的分子機制，在CHO細胞系中共轉染miR-148a-3p mimics與野生型載體PGL/PPARγ-WT或突變型載體PGL/PPARγ-Mut，采用雙熒光素酶報告系統檢測雙熒光素酶的活性。結果顯示，當miR-148a-3p與PPARγ的結合位點突變后，雙熒光素酶活性顯著升高(圖4，P<0.05)，證實PPARγ是miR-148a-3p的靶基因。

圖4 miR-148a-3p與PPARγ靶標關系的雙熒光素檢測

2.5 miR-148a-3p mimics和inhibitor對PPARγ表達的影響

為了探究miR-148a-3p對靶基因的轉錄調控的影響，在鵝卵泡顆粒細胞中轉染miR-148a-3p mimics和miR-148-3p inhibitor后檢測靶基因PPARγ的mRNA表達變化。結果如圖5所示，與mimics NC組相比，miR-148a-3p mimics能顯著降低鵝顆粒細胞中PPARγ的表達(圖5A,P<0.05)。與inhibitor NC組相比，miR-148a-3p inhibitor能顯著上調PPARγ的表達(圖5B,P<0.05)。由此可知，miR-148a-3p能調控靶基因PPARγ的轉錄水平。

A. miR-148a-3p mimics對PPARγ的mRNA表達的影響；B. miR-148a-3p inhibitor對PPARγ的mRNA表達的影響

2.6 干擾PPARγ對鵝卵泡顆粒細胞孕酮分泌的影響

為了探究miR-148a-3p是否會通過其靶基因的轉錄調控影響鵝卵泡顆粒細胞的激素合成，在顆粒細胞中干擾PPARγ后檢測關鍵基因的表達變化及孕酮含量。結果如圖6所示，與對照組和si-PPARγ NC組相比，干擾PPARγ基因后，3β-HSD的表達量顯著降低(圖6A,P<0.05)，孕酮的含量也降低，但差異不顯著(圖6B,P>0.05)。由此可知，鵝顆粒細胞中孕酮的含量受PPARγ的轉錄調控。

A.干擾PPARγ對3β-HSD的mRNA表達的影響；B.干擾PPARγ對孕酮合成的影響

3 討 論

miR-148a-3p的序列已經在多個物種中被鑒定[21]，而在鵝上，miR-148a-3p的序列是通過前期轉錄組測序獲得。本研究通過對多個物種的序列進行保守性比對分析發現，miR-148a-3p在不同物種中高度保守，推測miR-148a-3p在不同的物種中可能具有類似的功能，但關于miR-148a-3p調控鵝卵泡顆粒細胞類固醇激素分泌的相關研究未見報道。

目前的研究發現，miR-148a-3p在許多生理過程中均發揮重要作用，比如免疫、腫瘤和癌癥[22-23]，骨骼肌細胞的分化、增殖和凋亡以及脂肪細胞的增殖分化[24-26]。本研究中，miR-148a-3p在鵝不同發育階段的卵泡顆粒層中均有表達，且隨著卵泡直徑的增加，其表達量呈現先升高后下降的趨勢，在F4、F5階段卵泡達到頂峰。F4、F5階段卵泡為等級前卵泡發育到等級卵泡的過渡時期[27]，推測miR-148a-3p可能在卵泡發育或卵泡選擇過程中有重要作用，這也表明，miR-148a-3p也參與禽類的繁殖生理過程。進一步體外培養鵝顆粒細胞，轉染miR-148a-3p mimics能顯著下調3β-HSD表達，抑制孕酮的合成；而轉染miR-148a-3p inhibitor能顯著上調3β-HSD表達，促進孕酮的合成。3β-HSD是孕酮合成的關鍵基因[28]，禽類卵泡顆粒層中3β-HSD的表達量隨著卵泡的發育逐漸升高[29-30]。這些結果表明，miR-148a-3p可以抑制3β-HSD的表達降低孕酮的合成，進而影響鵝卵泡的選擇和發育。miRNAs主要通過與靶基因的3′-UTR結合調控靶基因表達繼而影響靶細胞的生物學功能[1]。研究表明，在食管癌中，miR-148a-3p通過靶向DNA甲基轉移酶1(DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1,DNMT1)調控癌細胞的增殖和入侵[31]。在人卵巢癌細胞中，miR-148a-3p通過靶向絡氨酸蛋白激酶Met(tyrosine-protein kinase Met,c-Met)抑制癌細胞的增殖[32]。而在正常的細胞中，如C2C12肌細胞系和原代老鼠細胞中，miR-148a能直接通過靶向含蛋白激酶1的Rho相關螺旋線圈(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1)的3′UTR來促進成肌細胞分化[33]。在牛的骨骼肌細胞中，miR-148a-3p通過轉錄后水平下調類Krüppel因子6(Krüppel-like factor 6,KLF6)的表達抑制成肌細胞的增殖，促進其凋亡[34]。而在雞的骨骼肌衛星細胞中，miR-148a-3p通過直接靶向間質同源框2(mesenchyme homeobox 2,Meox2)來促進細胞的分化，抑制凋亡，但不影響增殖，同時能增加PI3K/AKT信號通路[35]。本課題組前期通過靶基因在線預測軟件發現，miR-148a-3p與PPARγ3′-UTR存在潛在結合位點，雙熒光素酶報告載體試驗結果顯示，miR-148a-3p可以直接靶向結合PPARγ調控鵝顆粒細胞的生理功能。進一步檢測miR-148a-3p對PPARγ表達量的影響時發現，轉染miR-148a-3p mimics能顯著降低鵝顆粒細胞中PPARγ表達，而轉染miR-148a-3p inhibitor后，PPARγ的表達顯著升高。研究發現，PPARγ可以影響大鼠[36]、豬[37]、綿羊[38]、牛[39]卵巢顆粒細胞產生類固醇激素。Komar[40]研究表明，PPARγ可以引起人孕酮分泌量的改變。本研究中，干擾PPARγ能顯著降低3β-HSD表達水平和孕酮的含量。這些結果就表明，在鵝卵泡顆粒細胞中，miR-148a-3p通過靶向PPARγ來抑制3β-HSD的表達，進而降低孕酮的合成。

4 結 論

本研究發現，miR-148a-3p在鵝等級卵泡顆粒細胞中通過靶向結合PPARγ來抑制3β-HSD的表達，從而降低孕酮的合成，初步探討了miR-148a-3p對禽類卵泡顆粒細胞孕酮合成的分子機制，為深入探究miRNA在禽類卵巢顆粒細胞中的功能提供理論依據。