基于RNA-seq結果開發豬SSR標記

李文霞，吳怡琦，楊 帥，張燕偉，路 暢，楊 陽，蔡春波，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清

(山西農業大學動物科學學院，太谷 030801)

微衛星標記，又稱簡單序列重復(simple sequence repeat, SSR)或短串聯重復序列(short tandem repeat, STR)，主要分布于真核生物基因組，原核生物基因組中也偶有發現[1-2]。SSR標記由核心序列與側翼序列組成，核心序列為1～6個核苷酸串聯重復，重復次數為10～20次左右，如(AC)n、(CT)n、(TAT)n等；側翼序列位于核心序列兩側，屬于保守的特異單拷貝序列，使微衛星特異地定位于基因組特定部位[3]。Schl?tterer和Tautz[4]認為，SSR因核心序列重復次數的改變而顯現出高度變異性。SSR作為常見的分子遺傳標記，具有數量大、分布廣泛、檢測便利及信息含量高等特點，在遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構建、親子鑒定等方面具有積極的應用價值[5-7]。李軍成等[8]對高原小型蕨麻豬進行遺傳檢測，結果發現9個微衛星位點的平均等位基因數為6.11，平均雜合度為0.731 9，平均多態信息含量為0.765 9。牛榮等[9]利用35個微衛星位點對版納小耳豬的5個家系進行遺傳檢測，結果發現，各家系均已構成獨立的遺傳群體，其基因多態性和遺傳多樣性相比于普通商品豬較低。R?baa等[10]利用16個SSRs標記通過對數似然比方法成功鑒別了歐洲野生與家養豬種。Lin等[11]利用13個四核苷酸重復的SSR標記和1個性別鑒別基因構建了豬DNA鑒定系統，該系統可用于豬個體識別、親子鑒定及其他遺傳育種試驗。

開發SSR標記對于豬遺傳多樣性研究、特定性狀輔助育種及遺傳圖譜繪制等多個方面具有重大意義。傳統SSR標記的開發是通過構建基因組文庫進行篩選，過去大多數微衛星序列均是利用該方法獲取的。Groenen等[12]從豬基因組文庫中成功分離出了30個微衛星克隆，其中10個可作微衛星標記。傳統開發SSR標記方法操作繁瑣，費時費力且費用昂貴，一定程度上限制了SSR標記的研究與應用[13]。近年來，高通量測序技術的發展為全基因組水平篩選短串聯重復序列變異提供了基礎，已有大量基于高通量測序數據開發SSR標記的成功案例[14-16]。Liu等[17]利用基因組重測序數據，篩選出16 527個高質量多態性微衛星標記，將其應用于豬系統發育關系分析，結果發現，所有中國豬，包括兩頭野豬，聚集為一個分支，而所有商品瘦肉型豬聚集為一個分支。基于轉錄組測序結果開發SSR標記已在沼澤水牛[18]、四川白鵝[19]、黃菇魚[20]、羅氏沼蝦[21]、蘋果蝸牛[22]、南極魚[23]、泥鰍[24]、窄足真蚋[25]等動物中取得成功。

本研究基于課題組前期獲取的大白豬與馬身豬背最長肌RNA-seq結果，從預測的10 488個SSRs位點中隨機選擇154個進行檢測，共篩選出25個高多態性位點，并用于馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個豬種的遺傳多樣性分析，為進一步開展豬品種資源的保護和利用工作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

試驗動物選自山西大同市種豬場，采集健康、個體間無直接血緣關系的6月齡馬身豬(MS)、大白豬(LW)、晉汾白豬(JW)及山西黑豬(SB)等4個豬種各30份耳組織樣品(大約0.5 g)，放于裝有1 mL 700 mL·L-1乙醇的1.5 mL離心管中，于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 2×Taq Plus Master MixⅡ購自諾唯贊公司；Tris堿和EDTA購自華美公司；SDS(十二烷基硫酸鈉)、50×TAE電泳緩沖液、TEMED、Tris飽和酚、過硫酸銨、N，N-亞甲基二丙烯酰胺等購自北京索萊寶科技有限公司；6×DNA Loading Buffer購自康為世紀公司；DL500 DNA Marker、Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMD 18-T Vector、E.coliDH-5α Competent Cells購自TaKaRa公司，其余試劑為國產分析純。

1.2.2 主要儀器 Veriti 96 Well PCR儀(ABI，美國)；ND-1000核酸蛋白測定儀(Nanodrop，美國)；DYY-6C電泳儀(六一儀器廠，北京)；Centrifuge 5430R高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)；D1008E微型離心機(Scilogex，美國)、MX-S旋渦混合儀(Scilogex，美國)等。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬轉錄組數據來源及SSR位點分析 豬轉錄組數據來自于課題組前期利用Illumina HiSeq 2500測序平臺對6月齡大白豬和馬身豬各3頭豬背最長肌的轉錄組測序結果[26-27]。首先對測序獲取的原始數據(raw reads)使用Perl腳本進行質量控制，去除接頭序列、>10%的未知核酸序列以及質量分數≤10的堿基數占到整個堿基數50%以上的冗余序列，得到clean reads。利用bowtie2(v2.2.9)對clean reads建立索引，并通過Trinity軟件對clean reads進行拼接、過濾及組裝后得到高質量Unigenes，再利用tophat(v2.0.12)將質控后的序列片段mapping到豬基因組中，已知轉錄本信息以Ensembl ID命名，未知轉錄本信息以TCONS ID命名。

使用位點挖掘工具MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對豬轉錄組測序結果中序列長度大于1 kb的clean reads進行SSR位點搜索，檢測的SSR位點為單核苷酸至六核苷酸重復6類，設置參數為單核苷酸重復至少10次，二核苷酸重復至少6次，三、四、五及六核苷酸重復至少5次。復合SSR的兩個位點間最大間隔堿基數為100 bp。將最終生成的文本文件整合導入到Excel(Microsoft Office Excel 2016)中，并對SSR位點信息進行特征分析。

1.3.2 SSR位點篩選與引物設計 通過前期RNA-seq結果預測的SSR位點，根據其染色體位置、堿基類型、重復次數等差異將Excel中的所有SSR位點進行分類與統計，并利用OFFSET函數(=OFFSET(A$1，(ROW(A1)-1)×50)實現每隔50個位點自動篩選1個SSR位點，最終選擇200個SSRs位點進行引物設計。根據基因Unigene ID在Ensembl數據庫中查到SSR位點所對應的基因序列，從中選出合理長度并包含SSR位點的序列，使用Primer 3.0最終成功設計154對引物，由上海生工合成，部分引物信息見表1。

1.3.3 PCR擴增及多態性位點的篩選 按照酚/氯仿抽提法提取豬耳組織基因組DNA。將馬身豬、大白豬、晉汾白豬、山西黑豬等4個豬種分別10個 DNA樣品取適量體積，均勻混合為1個DNA池，最終每個豬種混合為3個DNA池。以混合DNA池為模板，用合成的154對引物進行PCR擴增和PAGE電泳，篩選多態性位點。PCR反應總體積為10 μL：DNA模板1.0 μL，2×Taq Plus Master MixⅡ 5.0 μL，Primer F(10 μmol·L-1)和Primer R(10 μmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O加3.0 μL。 反應程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s， 退火(表1)30 s， 72 ℃延伸30 s，35次循環；72 ℃ 延伸5 min，最后4 ℃保存。擴增產物經10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測效果較好的產物經100 g·L-1聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，可產生豐富多態性的SSR位點即為新篩選的SSR標記。利用篩選的多態性SSR對4個豬群體中所有個體進行PCR擴增和PAGE檢測，以評價新開發SSR位點的有效性和群體遺傳多樣性。

表1 引物信息

1.3.4 SSR多態性位點的克隆測序 為了驗證本研究所獲取SSR標記的準確性，對部分位點進行了克隆測序。采用“1.3.3”條件進行PCR擴增，總體系為200 μL。采用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，使用Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0對目的片段進行切膠回收，利用ND-1000核酸蛋白測定儀測定回收DNA濃度。將回收產物與pMD 18-T Vector 16 ℃連接過夜，采用熱激法將連接產物轉化至E.coliDH-5α感受態細胞中，在固體培養基中使用Amp抗性、X-Gal與IPTG篩選陽性菌株，37 ℃培養12 h。挑取陽性單個白色菌落在含Amp抗性的LB液體培養基中過夜培養，隨后進行菌液PCR鑒定，最后篩選陽性菌液送至華大基因公司測序。

1.3.5 數據處理 使用Pop Gene 3.2軟件統計SSR位點的平均等位基因數(allele number,Na)、有效等位基因數(effective allele number,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)等參數；使用PIC CALC程序計算多態信息含量(polymorphism information content,PIC)；使用NTsys 2.10e軟件計算遺傳距離。

2 結 果

2.1 SSR位點數量與分布特征

利用MISA搜索豬轉錄組序列SSR位點，設置的SSR長度均大于10 bp。結果從36 693條轉錄組Unigene序列(序列長度>1 kb)中搜索到10 488個SSRs位點，分布于6 953條Unigene序列中，堿基數目總長度221 838 bp，平均長度為21.15 bp。SSR發生頻率(含有SSR的Unigene數目與總Unigene數目之比)為18.95%，出現頻率(檢出SSR個數與總Unigene數目之比)為28.58%。其中4 727條Unigene含有單個SSR，2 226條Unigene含有2個及以上SSRs。在評估的所有Unigene序列中，SSR位點類型以純合型為主，有9 424個，以復合型存在的SSR有1 064個。

豬轉錄組SSR位點重復類型多樣，單核苷酸至六核苷酸重復的SSR均有出現，所占比例變化較大。SSR位點數量分析結果見表2，單核苷酸、三核苷酸及二核苷酸重復是優勢重復類型，分別有6 428、 2 414、1 413個，占比分別為61.29%、23.02%和13.47%；四、五、六核苷酸重復的分布頻率逐漸遞減，占比分別為1.62%、0.4%和0.2%。除三核苷酸重復外，SSR分布頻率隨核苷酸重復數增加而依次遞減。SSR重復次數主要集中于5～22次， 其中在5～11次的SSR最多，有6 032個，占比為57.51%；在12～22次的SSR次之，有3 917個，占比為37.35%；重復次數>22的SSR數量最少，有539個，占比為5.14%；重復次數在5～11、12～22、>22的SSR數量依次減少，表明SSR位點數隨重復次數的增加總體上呈現下降趨勢。其中單、二、三、四、五、六核苷酸重復數量最多的重復次數分別在12～22、6、5、5、5、5次。

表2 基于轉錄組豬SSR重復類型特征

2.2 SSR位點基序長度特征

統計SSR基序類型，將所有可循環的堿基序列及其互補堿基序列歸為一類。統計結果見表3，SSR共有121種基序類型，單至六核苷酸重復的基序類型分別有2、6、28、48、19、18種。SSR基序類型多樣(圖1)，其中單核苷酸重復的A/T類型數量最多，有5 804個，在單核苷酸重復中的占比為90.29%，總占比為55.34%；雙核苷酸重復的AC/GT類型數量最多，有400個，所占本類型比例為28.31%，總占比為3.81%；CA/TG的數量也較多，有392個，所占本類型比例為27.74%，總占比為3.74%；三核苷酸重復的GCC/GGC數量最多，有404個，所占本類型比例為16.74%，總占比為3.85%；CGC/GCG次之，有230個，所占本類型比例為9.53%，總占比為2.19%；四核苷酸重復的AAAC/GTTT數量最多，有20個，所占本類型比例為11.76%，總占比為0.19%；五核苷酸重復的AAAAC/GTTTT數量最多，有8個，所占本類型比例為19.05%；六核苷酸重復中的18種基序類型中，AGGCGC/GCGCCT、CCGGGG/CCCCGG均有2個，所占本類型比例均為9.52%；其余15種六核苷酸重復的基序類型均有一個，所占本類型比例共為71.43%。

圖1 基于轉錄組豬不同基序類型分布

表3 基于轉錄組豬SSR基序類型分布

2.3 豬轉錄組SSR可用性評價

SSR標記在種群中的多態性及多態性的高低是判斷其可用性的依據，而SSR序列片段總長度是影響多態性高低的重要因素之一。為了提高微衛星潛在的多態性差異，并增加結果的實用性，本研究只搜索長度在10 bp以上的SSR。結果見圖2，所發現的10 488個微衛星長度存在顯著差異，轉錄組SSR基序長度大多為10～20 bp，共7 817個，占比為74.53%；其次為21～30 bp，共1 480個，占比為14.11%；30 bp以上的微衛星數量相對較少，共1 191個， 占比為11.36%。研究結果表明，基于豬轉錄組測序結果獲得的SSR標記基序片段長度大多較長，總體具有較高的多態性和較強的實用性。

圖2 基于轉錄組的豬SSR重復長度分布圖

2.4 SSR引物有效性檢測

用設計成功的154對引物對馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個群體共120份DNA進行擴增，共有124對引物能擴增出明亮、特異的條帶，擴增效率為80.52%。經100 g·L-1聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，有25對SSR引物具有多態性(圖3)，占比為16.23%。

M. DNA相對分子質量標準(100～500 bp)；A、B、C、...... 為等位基因

2.5 SSR多態性位點克隆測序驗證

選擇多態性較好的6對引物P10、P22、P24、P59、P61、P66進行擴增，對PCR產物進行克隆測序，測序結果符合微衛星特征(圖4)，且與RNA-seq結果及聚丙烯酰胺凝膠電泳結果相符，表明本研究獲得的SSR位點真實可靠。

圖4 6對SSR引物的測序結果

2.6 SSR在不同豬種的遺傳多樣性分析

用上述開發的25個多態性SSR引物檢測馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個群體的遺傳多樣性，共獲得131個等位基因，等位基因數為2～7個，平均等位基因數為5.24，平均有效等位基因數為3.487 1。各位點PIC值介于0.378 3～0.805 3之間，平均值為0.646 7，觀測雜合度、期望雜合度分別為0.200 0～0.931 0、0.277 8～0.829 2。

不同豬種各位點等位基因頻率見表4，不同等位基因分布不均勻，各個位點都有優勢等位基因存在，其等位基因頻率大于0.5。就大白豬而言，P10A(P10的A等位基因，下同)、P24B、P146A等等位基因分別是其座位上的優勢等位基因；就馬身豬而言，P10B、P24A、P146A、P147A等分別是其座位上的優勢等位基因；就晉汾白豬而言，P10A、P24A、P56A、P146A、P147A等分別是其座位上的優勢等位基因；就山西黑豬而言，P10A、P56A、P146A、P147A等分別是其座位上的優勢等位基因。同時，P24E、P24F僅在馬身豬中出現，是馬身豬特有的等位基因，可作為區分馬身豬與其它品種的特異性標記；P147D僅在山西黑豬中出現，可初步判定這些等位基因或者其組合可以作為品種特異性標記。

表4 部分位點等位基因頻率

25對多態性引物中有23對引物在4個豬群中總體PIC大于0.5，屬于高度多態位點，而P10和P146在4個群體中的PIC均小于0.5，屬于中度多態(表5)。每個位點在不同豬種的多態性表現略有差異，馬身豬的P56位點多態性最高，其PIC為0.618 7；晉汾白豬的P69位點多態性最高，其PIC為0.716 8，表明馬身豬和晉汾白豬遺傳多樣性豐富。

表5 部分SSR引物在不同豬群體中的遺傳多樣性參數

2.7 不同豬群體間的遺傳相似性和遺傳距離分析

本研究利用25個微衛星位點分析了馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個群體間的奈氏遺傳相似性和遺傳距離，結果見表6。4個豬種間的遺傳相似性在0.473 7～0.800 7之間，其中，晉汾白豬與大白豬的遺傳相似性最高，為0.800 7，山西黑豬與晉汾白豬的遺傳相似性最低，為0.473 7。4個豬種間的遺傳距離在0.200 1～0.526 3之間，其中，晉汾白豬與大白豬的遺傳距離最近，為0.200 1，與馬身豬的次之，為0.428 6。該結果與晉汾白豬遺傳組成相一致。晉汾白豬是以大白豬、長白豬、馬身豬、二花臉為親本雜交培育而成的品種，在遺傳組成上，大白豬占50%的血液，馬身豬占6.25%的血液[28]。

表6 4個豬種間的遺傳相似性和遺傳距離

3 討 論

3.1 基于轉錄組的微衛星分布與特征分析

本研究對豬轉錄組測序結果中的Unigene進行SSR位點分布及序列特征分析，結果從36 693條 Unigene中找到10 488個SSRs位點，共分布于6 953條 Unigene。SSR發生率為18.95%，與其他物種相比，本研究中SSR位點的發生頻率明顯低于牙鲆轉錄組中的發生頻率(27.12%)[29]，而高于中華蜜蜂幼蟲腸道轉錄組SSR位點的出現頻率(17.82%)[30]，產生差異的原因可能與物種特異性有關，也可能與搜索標準的設定、原始序列數據、軟件類型、長度不同等有關。

本研究中，轉錄組測序結果的SSR種類豐富，包含一至六核苷酸重復類型，除單核苷酸重復外，三、二、四核苷酸重復為其優勢重復類型，分別有2 414、 1 413、170個，占比分別為23.02%、13.47%、1.62%，共占97.78%，五、六核苷酸重復類型數量較少，共計2.22%。本結果與大黃魚[31]和美洲大蠊[32]的優勢重復類型情況相同，與多數報道的以二、三、四核苷酸重復為其優勢重復類型的鯉魚[33]、團頭魴[34]、東方實蠅[35]等不同，可能與物種特異性主導微衛星重復類型有關。重復基序類型中，二核苷酸重復的AC/GT類型出現的頻率最高，與裂口腹魚[36]情況一致；三、四核苷酸重復基序類型中，GCC/GGC和AAAC/GTTT出現的頻率最高，其與日本七鰓鰻[37]和黃鯰[38]情況不同。并且所有三核苷酸重復類型中，GC含量較高，這種差異可能與物種組成結構相關，也可能與轉錄組SSR來源、密碼子偏倚、編碼蛋白質頻率較高有關，表明豬在生物進化地位中可能位于較高的進化水平。SSR位點多態性由于堿基數和重復數的不同而產生序列長度多態性。本轉錄組測序結果的微衛星基序長度大多集中于10～20 bp，共7 817個，占比74.53%；其次為21～30 bp，共1 480個，占比14.11%；大于30 bp的數量較少，共1 191個，占比11.36%。Temnykh等[39]提出，SSR長度大于或等于20 bp時，多態性較高，長度為10～20 bp的多態性中等，小于10 bp的多態性極低。所以本轉錄組測序發掘的SSR位點大多具有多態性潛能且多態性較高，可用于SSR標記的開發以及遺傳多樣性分析。

3.2 基于轉錄組測序結果開發SSR標記

理想情況下，微衛星屬于中性DNA標記，其特征相對恒定，只受隨機過程影響，如突變和遺傳漂變。但由于人工選擇的存在，微衛星標記實際上并不完全中立，過去開發的微衛星標記用于現在的遺傳育種工作，其準確性和實用性就會受到限制。Brenig和Schütz[40]研究表明，2004—2014年，ISAG推薦的12個微衛星組合標記小組對于牛親子鑒定準確性下降，需添加新的微衛星標記增加其準確性。但傳統開發SSR標記效率低下，費用昂貴，隨著高通量測序技術的興起，使得基于轉錄組測序結果開發新SSR標記變得簡便高效。

Liu等[41]基于轉錄組測序結果隨機挑選出100個位點，共有31個新開發的微衛星位點顯示出多態性，從中篩選出20個微衛星用于大白鱘的親子關系分析，其結果準確可靠。Gao等[42]基于轉錄組測序結果，隨機選擇50個SSRs位點檢測多態性，最終35對引物成功擴增，并在28只斑點海豹個體中檢測到顯著多態性。Lu等[43]基于轉錄組測序結果，隨機選擇43對引物對西伯利亞虎的DNA進行檢測，最終14對引物的擴增產物具有多態性，開發的SSR標記成功應用于野生和圈養西伯利亞虎的種群遺傳分析。Zhang等[44]基于轉錄組測序結果，隨機選擇300對SSR引物，對長湖、洪湖、南湖及洞庭湖的4個野生黃顙魚群體進行擴增驗證，其中263對引物有效擴增，57對引物在48條黃顙魚個體中被鑒定為多態性SSR位點。本研究基于豬RNA-seq結果，隨機選擇154個預測的SSRs位點檢測多態性，最終在馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個群體中篩選到25個高多態性位點。以上結果表明，基于高通量轉錄組測序結果開發SSR標記是可行的，且能夠用于動物的遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構建、親子鑒定等遺傳育種工作。

3.3 不同豬種遺傳多樣性分析

本研究基于RNA-seq結果開發出25個SSRs標記，將其應用于4個群體的遺傳多樣性分析，結果共識別到131個等位基因，等位基因數為2～7個，平均等位基因數為5.24，平均有效等位基因數為3.487 1，平均PIC為0.646 7，平均Shannon指數為1.355 1，總體表現出較高的多樣性。賀希文等[45]采用19個SSRs分析大白豬群體的遺傳多樣性，平均PIC為0.565 2；李楨等[46]研究表明，大白豬群體的PIC為0.408 4；與本研究結果相比，兩者均低于本研究結果(0.617 2)，表明本研究開發的SSR標記多態性高。曹果清等[47]利用FAO-ISAG推薦的21個微衛星標記檢測馬身豬遺傳多樣性變化趨勢，發現馬身豬群體PIC為0.341～0.441；而本研究中，馬身豬群體的遺傳多樣性較高，平均PIC為0.588 9，高于前者研究結果，表明本研究獲取的SSR標記多態性高，能充分反映馬身豬群體的遺傳多樣性，這與馬身豬豐富的遺傳組成相一致。

4 結 論

本研究基于豬轉錄組測序結果開發出25個多態性較高的SSRs標記，可用于馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個群體的遺傳多樣性分析，結果豐富了豬可用SSR標記數據庫，對豬的起源進化、群體遺傳結構分析、親子鑒定、遺傳圖譜構建、分子標記輔助育種等具有重要意義。