基于線粒體控制區的雞不同雜交組合遺傳多樣性研究

唐修君，樊艷鳳，賈曉旭，葛慶聯，陸俊賢，馬麗娜，韓 威，高玉時*

(1.中國農業科學院家禽研究所，揚州 225125； 2. 南京農業大學動物科技學院，南京 210095； 3. 江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，揚州 225125)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)為動物核外遺傳物質，發生變異的機率相對穩定，無遺傳重組，具有從母系起源上確定品種間遺傳關系的特點，通常能夠全面反映種群內和種群間的遺傳變異[1]，已成為探討種群遺傳結構、系統發育進化及種質鑒定研究的重要研究對象[2-4]。線粒體控制區又稱D-環區(D-loop區)，是一段非編碼區，其進化速率較線粒體其它區域快5～10倍，是研究親緣關系較近群體的起源進化和種質鑒定理想的分子標記[5-8]，目前已成功應用于豬[9-11]、牛[12-14]、羊[15-17]、馬[18-20]、驢[21-23]、鹿[24]和鴿[25]等多個物種的遺傳多樣性和系統發育研究。近年來，在對我國地方雞種遺傳多樣性和母系起源方面的研究顯示，線粒體D-loop區作為目標位點已逐漸成為研究熱點[26-28]。黃勛和等[29]基于線粒體DNA D-loop序列研究了廣東省和鄰省共12個地方雞品種間的遺傳距離和系統關系，系統評估了其遺傳變異水平并追溯了其母系起源。賈曉旭等[30]基于線粒體DNA控制區序列研究了我國華東地區11個地方雞品種的遺傳多樣性與親緣關系，并構建了其與紅色原雞系統發生的鄰接樹，探討了11個品種的母系起源。

隨著對線粒體基因組序列研究的關注熱度越來越高，在探討基于線粒體DNA的物種遺傳多樣性和起源進化的同時，對線粒體單倍型(世系)的劃分也有相關研究。Liu等[31]以線粒體控制區第一高變區為遺傳標記，深入研究了家雞的母系起源，揭示世界家雞和紅色原雞由9個母系世系構成，分別為A、B、C、D、E、F、G、H和I型。研究顯示，94.84%的家雞屬于A、B、C、E、F、G和I型，其中A和B型普遍存在于東亞和東南亞地區，C型為東亞特有，E型普遍存在于南亞和歐美地區，F和G型僅分布在中國云南地區，I型主要分布在中國云南地區。Miao等[32]構建了基于家雞線粒體全基因組序列的系統發育樹，詳細界定了各單倍型類群，并對世界各地家雞樣本mtDNA控制區序列進行了重新分析，確定了世界家雞及其近緣種紅色原雞可分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、W和X等世系。然而，這些研究的關注點基本集中于物種的遺傳多樣性和起源進化，即在不同單倍型的來源方面取得了諸多成就。但是很少有人關注不同單倍型究竟去了哪里，即對雜交后代(配套系)中單倍型的分布情況研究少之又少，迄今為止，對線粒體優勢單倍型在后代的分布和傳遞情況以及與雞生產性能相關性研究甚少，還未見相關報道。

本研究擬通過研究不同雜交組合雞群體中線粒體控制區遺傳多樣性特點和單倍型分布特征，探討線粒體優勢單倍型在不同世代間的傳遞規律，并通過與GenBank數據庫中紅色原雞序列的聚類分析探究其遺傳起源，為肉雞品種選育和溯源以及資源化開發利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以固始雞、藏雞、隱性白羽雞、正交F1代、反交F1代以及F2代等6個雞群共387只個體為試驗材料(表1)，雞種來源于國家級地方雞種基因庫(江蘇)，翅靜脈采血，ACD抗凝。其中正交F1代為固始雞(♂)×隱性白羽雞(♀)、反交F1代為隱性白羽雞(♂)×固始雞(♀)、F2代為藏雞(♂)×正交F1代(♀)。

表1 6個雞群體采樣數

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA的提取 采用常規酚/氯仿法[33]提取血樣基因組DNA，利用0.8%瓊脂糖(Promega，美國)凝膠電泳檢測DNA提取效果。

1.2.2 引物合成 利用Primer Premier 5.0軟件根據GenBank發布的紅色原雞線粒體控制區全序列(序列號: NC_007235)設計特異性引物1對，PF：5′-AAACACCCAAACTCACTAAC-3′；PR：5′- CACTGGGATGCGGATACTTGC-3′，預期擴增產物全長為1 586 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增和測序 擴增體系50 μL：2×PCR Master Mix(大連寶生物公司)25 μL，10 μmol·L-1上、下游引物(上海生工生物工程公司)各1.5 μL，DNA模板2 μL，滅菌雙蒸水20 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃ 延伸2 min，共32個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物采用1.0%瓊脂糖(Promega，美國)凝膠電泳檢測，之后選擇擴增效果良好的產物交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序，所有序列均采用雙向一代Sanger測序。

1.3 數據處理與分析

采用DNAStar 5.02 軟件SeqMan程序拼接序列，剪去多余片段，然后與參考序列進行逐堿基比對。利用MEGA 4.0軟件計算遺傳距離，構建基于雙參數遺傳距離的系統發育樹(neighbor-jointing, NJ)[34]。利用DnaSP 5.10 軟件統計突變位點總數(total number of mutations)、單倍型數(number of haplotype)、單倍型多樣度(haplotype diversity,Hd)、核苷酸多樣度(nucleotide diversity,Pi)以及平均核苷酸差異(average number of nucleotide differences,K)等遺傳多樣性信息[35]。利用Network 10.1軟件構建中介網絡關系圖(median- joining)(www.fluxus-technology.com)。

2 結 果

2.1 線粒體控制區序列分析

統計分析6個群體387個個體PCR產物測序結果，發現所研究雞樣本線粒體控制區全序列大小為1 231 bp，與參考序列NC_007237比對顯示，所有個體均在859 bp處存在C堿基缺失。多態性分析顯示，387條序列共檢測到28個單核苷酸突變位點，其中單一多態位點3處，分別位于211、321和927 bp處；其余突變位點均為簡約信息位點。突變類型以轉換為主，其中T-C轉換20處，A-G 轉換8處。 堿基組成分析顯示，T、C、A和G堿基含量分別為33.5%、26.6%、26.5%和13.4%，A+T含量為60.0%，G+C含量為40.0%。

2.2 線粒體控制區單倍型分析

6個群體單倍型分析顯示，28個突變位點共組成19種單倍型，可以劃分為A、B、C、E 4個單倍型群(分支)，其中A單倍型群包括7個單倍型共116個 個體，B單倍型群包括4個單倍型共36個個體，C單倍型群包括5個單倍型共132個個體，E單倍型群包括3個單倍型共103個個體。各單倍型數量及在群體間的分布情況見表2。其中，單倍型C1出現頻率最高，在5個群體中共出現122個個體；其次是單倍型E1，在3個群體中共出現92次；第三是單倍型A1，在4個群體中共出現72次；這3種單倍型共計286個個體，占樣品總數的73.9%。

表2 6個群體線粒體D-loop區單倍型數量分布

進一步分析顯示，固始雞(GS)主要有A、C單倍型，占比分別為53.42%和46.58%，反交F1代(YG)與GS一樣，主要有A、C單倍型，占比分別為50.75%和49.25%。正交F1代(GY)、F2代和隱性白羽雞(YXB)的A、B、C、E四種單倍型占比相近，E單倍型為這3個群體的優勢單倍型，占比分別為48.84%、50.00%和48.89%。結果見表3。

表3 不同群體D-loop區全序列單倍型匯總

2.3 6個雞群體線粒體控制區遺傳多樣性和遺傳距離

6個雞群體遺傳多樣性分析結果見表4，平均核苷酸差異(K)分布在4.192～6.655之間，其中最高為正交F1代(GY)，最低為藏雞(Z)；核苷酸多樣度(Pi)分布在0.003 40～0.005 41之間，其中最高為GY，最低為Z；單倍型多樣度(Hd)分布在0.496～0.729之間，其中最高為GY，最低為Z。反交F1代(YG)與固始雞(GS)遺傳多樣性相近，GY和F2代與YXB遺傳多樣性相近。

表4 6個雞群體線粒體控制區的遺傳多樣性

6個雞群體平均遺傳距離結果見表5，種群內遺傳距離范圍為0.003 4～0.005 5，最小為藏雞(Z)，最大為正交F1代(GY)。種間遺傳距離大小體現了雞種之間親緣關系的遠近，最大為Z與隱性白羽雞(YXB)、GY、F2之間(均為0.009 1)；最小為固始雞(GS)與反交F1代(YG)之間(0.004 3)；YXB、GY以及F2代兩兩之間遺傳距離相近。

表5 基于Kimura雙參數模型計算的6個群體平均遺傳距離

2.4 系統進化樹和中介網絡圖的構建

對6個群體387個個體19種單倍型構建了NJ系統進化樹，結果如圖1所示，19種單倍型明顯地被分成了A、B、C和E等4個支系，分別含有116、36、132和103條序列。用Network10.1軟件構建的網絡關系圖也證實了這一點，如圖2所示，中介網絡圖主要有4個進化枝，分別以A1、B1、C1和E1為中心節點，這4種單倍型在各自的單倍型類群里出現的頻率最高。

圖1 基于NJ法構建的6個雞群體線粒體控制區不同單倍型系統發育樹

圖2 6個雞群體mtDNA 控制區19種單倍型Network圖

同時，結合本研究中387條序列19種單倍型和從GenBank數據庫下載的19條紅色原雞線粒體控制區全長序列，采用K2P模型構建了系統發育樹，如圖3所示，單倍型A、B、C和E在發育樹中形成了4個大分枝，2個原雞海南亞種個體GGJ1和GGJ2單獨形成一枝。7種A單倍型和4種B單倍型僅與原雞滇南亞種交叉聚為一枝，其中A單倍型群均與滇南亞種GGS5(GU261695)聚為一枝；B單倍型群均與滇南亞種GGS1(NC007235)和GGS8(GU261704)2條序列交叉聚為一枝。3種E單倍型均與紅色原雞印度亞種(GGM1、GGM3和GGM4)交叉聚為一枝。5種C單倍型與印尼亞種(GGB)、指名亞種(GGG1、GGG2)、印度亞種(GGM2)以及滇南亞種(GGS10、GGS3、GGS9)等4種 紅色原雞亞種7條序列交叉聚為一枝。

GGG. 原雞指名亞種；GGS. 原雞滇南亞種；GGM. 原雞印度亞種；GGJ. 原雞海南亞種；GGB. 原雞印尼亞種

3 討 論

3.1 6個群體mtDNA控制區全序列單倍型特征

本研究中，6個群體387個個體測序結果顯示，線粒體控制區全序列大小為1 231 bp，所有個體均在859 bp處有1個C堿基缺失，共檢測到多態位點28個，發現單倍型19種，按照雞線粒體DNA單倍型分類通用標準[31]，可分為A、B、C和E共4個 單倍型群(分支)，每個分支分別有116、36、132和103個個體。由構建的NJ系統進化樹和Network中介網絡圖均可以看出，387個個體明顯地被分成了A、B、C和E等4個支系，其中A1、B1、C1和E1分別為各個支系的主要單倍型。

進一步分析顯示，反交F1代與固始雞一樣，主要有A、C兩種單倍型，他們的占比非常接近，固始雞A、C兩種單倍型占比分別為53.42%和46.58%，反交F1代占比分別為50.75%和49.25%。正交F1代和F2代與隱性白羽雞一樣，均含有A、B、C和E共4種單倍型，3個群體4種單倍型占比相近，均是以E單倍型為優勢單倍型，其中隱性白羽雞的占比為48.89%，正交F1代和F2代 E單倍型占比分別為48.84%和50.00%。在本研究中，試驗雞主要采用自由交配的方式，因此后代的幾種單倍型比例均與母系的單倍型比例相似。但在實際生產或進化過程中由于自然選擇和人工選擇的干預，或者基因序列的突變，往往造成某些單倍型的遺失或改變，進而影響后代的單倍型比例。雖然一直以來，研究者認為mtDNA遵循母系遺傳方式遺傳，但也有研究顯示，動物mtDNA存在重組現象，且最可能的途徑是父系滲漏[36]，在人類線粒體遺傳研究中發現存在雙親線粒體DNA遺傳的可能性[37]，但在其他物種中還未發現雙親遺傳的證據。本試驗結果顯示，在固始雞與隱性白羽雞的雜交傳代過程中，線粒體D-loop區在世代傳遞過程中仍遵循著嚴格的母系遺傳特點。

線粒體E分支為印度半島、中東和歐洲大陸地方雞種的主要單倍型，研究顯示，E單倍型在中快速型肉雞以及高產蛋雞中普遍存在，在中國少數地方雞種中也能檢測到，但是所占比例均較低，至今為止未發現占絕對優勢(比例在80%以上)的品種[38]。本研究也證實了這一點，在對固始雞和臧雞研究時發現，所采集的111個樣本中均未發現E單倍型個體，說明這兩個地方雞種在長期的進化過程中受外來雞種入侵機會較小，可能跟當地交通不便或者高山等天然屏障有關，從而保護了該品種的獨有特性。有研究顯示，利用線粒體標記可以進行分子輔助育種，早在1985年，Bell等[39]研究認為，細胞質效應對奶牛的產奶量、乳脂率等生產性能有影響，且假設這種影響是mtDNA的遺傳效應引起的。Toelle等[40]通過研究杜洛克豬和約克夏豬的細胞質母系效應，發現對初生重、斷奶重和背膘厚度等有重要影響。錢明娟等[41]采用線粒體基因組DNA超純提取和多態性擴增的方法，開發了一套水稻線粒體基因組分子標記，并用于水稻不育系品種鑒定和細胞質進化研究。雖然目前有關線粒體分子標記在雞育種方面的研究還未見相關報道，然而基于線粒體E單倍型在中快速型商品代肉雞培育過程中的重要貢獻以及線粒體母系遺傳的獨有特性，在今后的育種工作中，可以結合線粒體單倍型特征和育種目標，加快培育出滿足消費者需求的品種(配套系)。

3.2 6個雞群體mtDNA 控制區遺傳多樣性

單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)是衡量一個群體mtDNA變異程度的重要指標，通常情況下Hd和Pi值越大，群體遺傳多樣性越豐富，選擇潛力也越大[42-43]。本研究中，藏雞Hd、Pi值以及K值均較低，說明藏雞遺傳多樣性相對較為貧乏，選擇潛力相對較小，質量性狀趨于穩定。藏雞主要采用保護區和基因庫保護，據資料顯示，自2002年開始已經過多個世代選育，目前群體的遺傳特性和生產性能均保持相對穩定[44]。進一步分析顯示，固始雞遺傳多樣性程度與以其為母本的F1代(反交F1代)相近，而隱性白羽雞遺傳多樣性程度與以其為母本的F1代(正交F1代)以及以F1代母雞為母本的F2代相近。可見線粒體控制區的變異程度也是遵循著母系遺傳特征世代傳遞的。

種間遺傳距離大小體現了不同雞種之間親緣關系的遠近，本研究中，Kiumura雙參數距離結果顯示，固始雞與以其為母本的F1代(反交F1代)之間遺傳距離最小，藏雞與隱性白羽雞、正交F1代以及F2代之間遺傳距離最大。藏雞和正交F1代分別為F2代群體的父本和母本，研究顯示，藏雞與F2代之間的遺傳距離為0.009 1，而正交F1代與F2代之間的遺傳距離為0.005 3，可見相對于父本，母本與其子代之間的親緣關系更近，而隨著線粒體的世代傳遞，母本與下一代的親緣關系基本不變，本試驗中，母本隱性白羽雞、以隱性白羽雞為母本的F1代(正交F1代)以及以F1代母雞為母本的F2代兩兩之間遺傳距離非常相近。

3.3 6個雞群體系統發生關系

迄今為止，家雞究竟起源于哪種紅色原雞還沒有明確定論。Fumihito等[45]的研究提出，生活在泰國及其周邊的原雞指名亞種(Gallusgallusgallus)是家雞的唯一祖先。而Kanginakudru等[46]研究表明，生活在印度及其周邊的原雞滇南亞種(Gallusgallusspadiceus)和印度亞種(Gallusgallusmurghi)在家雞進化過程中貢獻相當。本研究將所發現的19種單倍型與從NCBI下載的19條紅色原雞線粒體控制區全長序列聯合分析，構建了K2P模型系統發育樹，結果顯示，A分支中的7種單倍型和B分支中的4種單倍型均僅與原雞滇南亞種聚為一枝，A、B單倍型為我國地方雞種的主要單倍型[13]，推測原雞滇南亞種在我國地方雞種長期馴化形成過程中母系貢獻較大。E分支中3種單倍型均與原雞印度亞種聚為一枝，E單倍型在南亞和西方商品雞中普遍存在，我國快長型雞種在培育過程中可以引入這些外來雞種血液，從而提高肉雞生長速度或者蛋雞產蛋性能。C分支中5種單倍型與原雞指名亞種、滇南亞種、印度亞種以及印尼亞種(Gallusgallusbankiva)等4種紅色原雞亞種交叉聚為一枝，母系起源頗為豐富，推測擁有C單倍型的雞種在其形成過程中可能受到了多種紅色原雞血液的入侵，然后經過長期的馴化逐漸形成了具有本身獨特個性的群體。

4 結 論

本研究在6個雞群體387個個體線粒體控制區全序列共發現了28個突變位點和19種單倍型；在固始雞與隱性白羽雞的雜交過程中，線粒體控制區在雞種中遵循著嚴格的母系遺傳，不同雜交組合和不同世代中后代與其母本的遺傳多樣性、單倍型數以及單倍型比例非常接近；19種單倍型共分為A、B、C和E共4個分支，A、B分支均主要起源于原雞滇南亞種，E分支主要起源于原雞印度亞種，C分支母系起源較為豐富，包括原雞印度亞種、滇南亞種、指名亞種和印尼亞種。