鴨坦布蘇病毒病的研究進展

張帆帆，曾艷兵，方紹培，李海琴，康昭風，譚美芳，譚 佳，楊 群，韋啟鵬

(江西省農業科學院畜牧獸醫研究所，南昌 330200)

鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)是黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的一種新型黃病毒，可引起雛鴨腹瀉和神經癥狀，蛋鴨卵巢出血壞死、產蛋量急劇下降，嚴重者出現死亡的急性高度接觸性傳染病[1-2]。2010年，鴨坦布蘇病毒病在我國福建、浙江、江蘇等地區的蛋種鴨中首次暴發，以種鴨和蛋鴨易感性最高。目前，該病的感染宿主已擴大至肉鴨、番鴨、鵝、蛋雞、鴿子、麻雀等多種禽類，給我國養鴨業造成了巨大的經濟損失，嚴重威脅養禽業健康發展[3-10]。

自2014年后，我國陸續研制出了DTMUV弱毒疫苗、滅活疫苗等多種疫苗，商業化疫苗的廣泛使用讓我國鴨坦布蘇病毒病發病率急劇下降，僅呈現散發狀態[5, 11]。然而，參與病毒吸附、侵入和宿主特異性免疫反應等重要過程的抗原蛋白(E蛋白)發生重要變異，進而引發免疫失敗或疫苗保護率下降，致使DTMUV的防控難度增加[12]。此外，DTMUV還可在小鼠體內復制，具有高度的神經毒性和與年齡相關的神經侵襲性，并且對人神經和肝細胞系也高度敏感，具有潛在的人獸共患風險，因此，對DTMUV進行深入研究具有重要意義[13-15]。本文結合DTMUV的分子生物學特征、流行現狀、天然抗病毒的分子機制以及疾病診斷的研究進展進行綜述，以期為該病原的基礎研究和診斷防控提供參考。

1 DTMUV分子生物學特征

DTMUV屬于黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的成員，為有囊膜單股正鏈線性的RNA病毒，呈二十面體對稱，具有典型的黃病毒形態。病毒基因組全長約11 kb，只包含一個開放閱讀框(open reading frame，ORF)編碼多聚蛋白前體，該蛋白前體可由病毒蛋白酶和宿主蛋白酶剪切成3個結構蛋白(核衣殼蛋白C、前膜蛋白prM和囊膜蛋白E)和7個非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)，基因組結構為5′-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-UTR-3′(圖1)[9]。黃病毒通常以帽子依賴的方式翻譯，而登革病毒、寨卡病毒、乙腦病毒、坦布蘇病毒可以通過不依賴帽子的方式在哺乳動物、鳥類和蚊子細胞中翻譯。抑制非帽子依賴性翻譯的突變降低了DTMUV的增殖，延遲了受感染鴨胚的死亡，但不能阻止死亡[16]。因此，DTMUV的5′UTR和3′UTR使病毒能夠使用不依賴于帽子和內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)的RNA基因組翻譯策略，這不僅可以逃避宿主翻譯中斷，還可用于生產黃病毒的減毒變異體作為潛在的候選疫苗。核衣殼蛋白C能與病毒基因組相互結合組裝成核衣殼，保護基因組免受RNA酶降解。prM是M蛋白的前體蛋白，成熟的M蛋白嵌合在病毒囊膜的脂質雙分子層中，對維持E蛋白的空間構象十分重要[9]。E蛋白是DTMUV最大的結構蛋白，參與病毒吸附、侵入和宿主特異性免疫反應等重要過程，與不同毒株間的毒力差異密切相關[17-18]。E蛋白經過不同程度的空間折疊可以形成特殊的空間結構，可以分為3個區域：中央結構域、強親水結構域和C末端結構域。中央結構域在強親水結構域和C末端結構域之間起到連接兩個結構域的橋梁作用；強親水結構域主要參與E蛋白二聚體的形成過程；而C末端結構域的主要作用是介導病毒與宿主細胞受體的結合從而促進病毒進入細胞。同時，該蛋白有多個能誘導機體產生特異性中和抗體的病毒毒力決定簇，可以引發保護性免疫應答，廣泛應用于疫苗研究中，是疫苗研制的潛力蛋白[19-21]。

圖1 鴨坦布蘇病毒基因組結構示意圖

非結構蛋白與結構蛋白緊鄰，主要在病毒入侵、復制和翻譯過程發揮重要作用，但許多功能及其作用機制依然未知。非結構蛋白NS1屬于高保守性的分泌型糖蛋白，依靠其可溶性補體結合活性誘導產生非中和性抗體，并且與病毒復制、抗病毒感染、免疫調節作用相關[22]。NS2A和NS2B均為疏水性蛋白，其可以相互作用構成病毒的主要蛋白酶，對病毒多聚蛋白進行剪切和加工[23]。NS3具有絲氨酸蛋白酶、核苷酸三磷酸酶和RNA解旋酶活性，可參與病毒RNA的復制，改變病毒與宿主的相互作用。研究顯示，NS3的HELICc結構域與PRDX1結合，調節p38/絲裂原活化蛋白激酶通路，使病毒逃避宿主免疫反應[24]。NS4A和NS4B在病毒復制和病毒-宿主相互作用中起多種作用，NS4A與NS3、NS4B與NS5形成的蛋白復合體，抑制宿主細胞產生的抗病毒反應。NS5為黃病毒分子量最大、最保守的蛋白，含有甲基轉移酶和RNA依賴的RNA聚合酶活性，可抑制干擾素和IL-8的表達。根據其保守性和在病毒復制過程中的重要功能，可用于開發診斷和治療方法[25-26]。

2 DTMUV的流行現狀

1955年，在馬來西亞的三帶喙庫蚊中首次分離出坦布蘇病毒原型毒株MM1775。2007年，在泰國觀察到一種與鴨嚴重神經癥狀和產蛋損失有關的嚴重傳染病，病原為DTMUV[27-28]。2013—2014年，泰國多家農場發生了DTMUV疫情，平均感染率為17.19%，死亡率為10%～30%[29]。1995年，我國河北地區發生鴨繁殖障礙和神經系統失調的疫病，直至1997年才分離到DTMUV毒株。2010年以來，DTMUV以高感染率(高達90%)和較高死亡率(5%～30%)為特征，在我國各養鴨場大面積暴發[30-31]。該病首先發現于浙江，隨后蔓延至沿海13個省市的主要養鴨地區，以雛鴨生長遲緩、厭食和死亡，蛋鴨產蛋下降、腹瀉且排綠色糞便為基本臨床特征，病程長達數周，可繼發大腸桿菌感染，是嚴重危害我國養鴨業的核心傳染病[32]。DTMUV對7周齡以下的雛鴨具有較強致病性，其中雛鴨感染日齡對疾病嚴重程度有很大影響[33]。DTMUV感染1～9日齡北京鴨后導致18%～100%的死亡率；而感染2～7周齡北京鴨，不同毒株所導致的嚴重程度不一，但無死亡發生。此外，研究發現，DK/TH/CU-1毒株感染4周齡鴨只，出現了22.86%的死亡率。蛋鴨感染后2 d出現厭食，3～4 d出現產蛋急劇下降，甚至絕產，并伴有綠色糞便，其中新開產鴨群表現最為嚴重。Yang等[34]通過建立雛鴨TMUV感染模型，證實TMUV進入中樞神經系統后在腦微血管內皮細胞內存活和增殖引起腦炎，最終破壞血腦屏障。肉鵝感染TMUV的發病日齡在40～60日齡，表現為拉綠色稀便，翅和雙腳麻痹，死淘率約10%。然而在2019年3月，我國東北地區的金定鴨群出現以翻個、腳軟、排綠色稀糞為特征的DTMUV感染病例，無明顯的細菌感染，2～4周齡 鴨死亡率高達40%，5～6周齡鴨的死亡率高達25%，7～8周齡鴨的死亡率低于10%[4, 11, 35]。通過致病性試驗分析發現，DTMUV H毒株(2.1亞群)比Y毒株(2.2亞群)對3周齡雛鴨的致病性更強[11]。最新的一項研究發現，TMUV病毒的E蛋白T367K突變在病毒細胞適應和毒力衰減中起著主導作用，并且NS1在遺傳進化上為病毒的高變區，其是否為影響病毒臨床癥狀的改變因素需要進一步研究[4, 18, 24]。根據DTMUV ORF核苷酸的遺傳進化關系可分為3個群，中國主要流行2.1亞群、2.2亞群和3亞群，泰國和馬來西亞等地區主要流行1亞群和2.1亞群[36]。通過地理系統分析表明，坦布蘇病毒可能是從馬來西亞、泰國等東南亞國家向中國華南地區擴散，并進一步向山東等北方地區擴散。通過病毒監測發現，在鴿子和野鴨等野生鳥類中檢測出TMUV，而東亞-澳大利亞飛行通道是世界上候鳥的主要飛行通道之一，該飛行通道經過許多國家，包括馬來西亞、泰國和中國等。因此，TMUV的傳播可能通過該飛行通道的候鳥傳播，還需要對候鳥感染TMUV的流行病學進行進一步的研究來確定[37]。近幾年來，鴨坦布蘇病毒病在我國各地此起彼伏，時有發生，并且不斷有DTMUV感染種雞、蛋雞和鵝等禽類的報道。在自然條件下，DTMUV可通過庫蚊作為媒介傳播病毒，是該病表現出明顯季節性的重要原因[38]。但通過長期的監測發現，該病在一年四季均可發生，在秋冬季節依然出現流行，說明其還可通過其他的傳播途徑感染。鳥類尤其是家禽是DTMUV的儲存宿主，在傳播過程中可能起著非常重要的作用[39]。此外，糞口傳播、空氣傳播和垂直傳播也是該病的主要傳播方式[40-41]。

3 DTMUV與宿主天然免疫應答

3.1 先天免疫應答

宿主的天然免疫是抵御病原體入侵的第一道防線，在早期抵御病毒感染中發揮重要作用。模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)是先天免疫系統的重要組成部分，可以識別病原體，激活特定的信號級聯，誘導Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)和促炎性細胞因子的產生，最終導致先天免疫的建立和獲得性免疫的發展。在天然免疫的主要四大信號通路中，其模式識別受體(PRRs)主要包括Toll樣受體(TLRs)、RIG-I樣受體(RLRs)、NOD樣受體(NLRs)和DNA受體(AIM2、cGAS、DAI)等。不同的PRRs定位在細胞不同位置：TLRs主要鑲嵌在細胞表面或細胞內雙層膜結構中；RLRs主要定位在細胞質，它們特異性地識別相應病原微生物PAMPs分子；DNA受體主要定位在細胞質，識別胞質中的dsDNA結構，是一組I型跨膜蛋白，感知不同的入侵病原體在細胞膜外以及內體和溶酶體內的情況。在鴨中的TLRs包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR7，可以感知細胞膜外的病原體及內吞小體內的病毒和微生物體基因組。DTMUV感染鴨胚成纖維細胞，TLR5和TLR3轉錄水平顯著上調，而TLR7的表達水平出現下調。激活的TLR3和TLR7募集接頭蛋白，分別誘導TRAF6和MyD88，TRAF6與RIP1、TAK1結合蛋白2、TAK1結合蛋白3、NEMO等形成的復合物，MyD88通過下游分子IRF-1誘導Ⅰ型干擾素的產生，抵御DTMUV的感染(圖2)[42-43]。體內試驗結果顯示，DTMUV感染大腦和脾后2 h，TLR3表達量分別增加了28.54倍和1.57倍[44]。以上結果都表明，TLR3介導的信號通路是抑制DTMUV復制所必需的。RLR家族的3個成員RIG-I、MDA5和LGP2可在大多數的組織中表達，其作為細胞質的受體能夠感應并識別各種不同病毒的RNA，并激發下游信號通路，誘導Ⅰ型干擾素產生和抗病毒基因表達。通過試驗發現，RIG-I和MDA5參與了宿主對DTMUV的天然免疫應答[45-47]。通過研究證實，MAVS的過表達顯著降低了DTMUV的復制，而其敲除增加了DEF細胞中的病毒滴度，并且顯著降低了DTMUV誘導的IRF1、NF-κB和IFN-β的激活[48]。此外，利用LC-MS/MS對DTMUV感染鴨的卵泡蛋白質組進行定量分析表明，RLR信號通路參與了DTMUV感染，在感染DTMUV的雛鵝中，RIG-I、MDA5、LGP2和干擾素基因刺激物(STING)在感染后5 d都顯著增加[49]。除了TLR和RLR外，其他PRRs包括NOD樣受體、胞漿DNA受體在應對微生物感染方面也起著至關重要的作用。研究發現，DDX3X和DDX5在DTMUV感染的BHK21細胞中顯著減少，其中，DDX3X過表達通過TBK1蛋白調控IFN-Ⅰ抑制DTMUV的增殖，其結果與在其他哺乳動物細胞中檢測到的DDX5不同，表明鳥類和哺乳動物對DTMUV的先天免疫應答可能存在差異[50]。雖然DTMUV感染可能涉及多種PRRs，但目前僅關注這些PRRs的表達變化，其具體功能有待進一步研究。

3.2 免疫逃避

在感染早期，真核生物依賴PRRs識別PAMPs到最終產生IFN-Ⅰ來抵御病原微生物入侵。研究已經證實了DTMUV進化出多種策略阻斷IFN-Ⅰ產生過程中的信號傳遞，包括阻斷病原的識別、操縱信號通路的關鍵分子、調控IFN-Ⅰ基因轉錄和翻譯等(圖2)。MDA5和TLR3依賴的信號通路誘導IFN-Ⅰ的表達，對抵御病毒的復制具有重要作用。DTMUV感染DEF細胞外分泌體中的miR-148a-5p可以靶向TLR3，下調IFN-β的表達，從而逃避宿主的天然免疫應答[46]。研究還發現，DTMUV感染DEF細胞導致miR-148a-5p的下調，進而導致SOCS1表達的上調；同時，miR-221-3p的表達水平也出現上調，促使SOCS5表達的下調，兩種途徑均可抑制IFN-β的表達使病毒逃避宿主的免疫應答反應[46]。DTMUV的蛋白通過不同的策略抑制IFN產生，也是病毒逃逸宿主免疫反應的重要途徑。DTMUV的NS1蛋白靶向MAVS，阻斷RIG-I/MDA5和MAVS的結合，顯著抑制病毒觸發的IFN-β的表達[22]。NS1蛋白的表達導致RPS7和MDM2的低表達，最終導致p53的高表達[24]。p53已被報道是抵抗大多數病毒(包括HIV-1、HCV、PEDV、FMDV和NDV等)復制的重要宿主限制因子，通過影響宿主細胞的周期阻滯、DNA修復、自噬、衰老和凋亡促進病毒的感染，而p53的高表達對DTMUV復制的影響通路還有待進一步驗證。DTMUV NS2A以劑量依賴的方式顯著抑制RIG-I、MDA5、MAVS、STING、TBK1誘導的IFN-β的轉錄，促進病毒的感染。NS2A與TBK1競爭結合STING，破壞依賴于STING的抗病毒細胞防御，為DTMUV抵御宿主天然免疫反應的一種新的機制[45]。

圖2 DTMUV感染和病毒逃逸機制介導的先天免疫應答模式圖[51]

4 DTMUV的診斷與防控

病毒分離與鑒定是診斷病毒性疾病的金標準，可利用病鴨的卵巢、脾及腦等組織，經研磨、離心、過濾后接種雞胚/鴨胚，亦可用DEF、CEF、BHK-21、DF-1和Vero等細胞系進行病毒的分離鑒定，其中，BHK-21細胞對DTMUV的分離率最高[52]。但該方法對于研究人員的操作技術要求較高，且成功率相對較低。自DTMUV暴發以來，已開發了大量病原學(RT-PCR、RT-qPCR、RT-LAMP及高通量測序等)[25,53-54]和血清學(ELISA、膠體金免疫層析及中和試驗等)[55-58]的檢測方法，其中，RT-PCR為最廣泛的病原檢測方法，適用于流行病學調查和臨床診斷。SHERLOCK是Zhang團隊基于Cas13a非特異RNA切割系統開發的一種快速、廉價、高靈敏度的新核酸診斷技術，以此開發的DTMUV檢測方法具有極大的應用前景[59]。

自2010年DTMUV在我國暴發以來，已成為養鴨業的重要疾病，給養鴨業帶來了巨大的經濟損失。疫病防治的核心為“防重于治”，需從生物安全防控、飼養管理及養殖方式等多方面采取合理的防控措施控制疫病的傳播與擴散。目前，疫苗免疫是DTMUV最重要的防控方式之一，研發的滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗均取得了良好的預防效果。DTMUV弱毒株的制備主要依靠細胞或禽胚上連續傳代致弱和使病毒毒力基因突變或者重組的基因工程方法。將DTMUV分離株FX2010在CEF細胞中連續傳代至P180，致弱毒株接種鴨群后能誘導良好的免疫應答，且能完全抵抗強毒株的攻擊，并已開發成為商品化弱毒苗[60]。而He等[61]使用從麻雀中分離到的DTMUV強毒株在SPF雞和鴨胚胎中交替傳代連續傳代至第70代，致弱毒株免疫雛鴨后具有極好的免疫原性和安全性，對DTMUV強毒株感染的保護率為100%。在滅活疫苗中添加IL-2比未添加的滅活疫苗可顯著增強機體的體液和細胞應答，誘導的抗體水平更高，同時減少了接種抗原的劑量，可有效解決接種量大、免疫周期短、效果不完全等局限性[62]。DTMUV基因工程疫苗的研究主要集中在重組抗原疫苗、重組載體疫苗及DNA疫苗。研究發現，DTMUV E蛋白的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ結構域均能誘導小鼠產生抗體，利用桿狀病毒表達系統構建的截短的E蛋白能誘導雛鴨產生特異性抗體反應，可抵抗DTMUV感染[19-21]。基因重組載體疫苗具有安全性高、免疫原性好等特點。有學者利用重組腺病毒和沙門菌作為載體開發DTMUV重組載體疫苗，可刺激機體產生較高水平的細胞免疫應答，并產生高水平的中和抗體，產生100%的攻毒保護作用[63]。DNA疫苗也是DTMUV疫苗研究的熱點，雛鴨肌肉注射基于SFV復制子和DTMUV E蛋白的DNA疫苗后，所有免疫的雛鴨都產生了強烈的體液和細胞免疫反應，并能抵抗DTMUV AH-F10強毒株的攻擊，為新型疫苗的開發提供了新的思路[64]。衣殼蛋白靶向滅活(CTVI)是一種概念上強大的新型抗病毒策略，它基于病毒衣殼蛋白與核酸酶的融合蛋白裝配到病毒粒子中，以破壞病毒DNA/RNA或干擾病毒關鍵蛋白的正確折疊。利用該策略發現，DTMUV衣殼融合蛋白可以在敏感的BHK21細胞中表達而不產生細胞毒性，并且具有良好的鈣依賴核酸酶活性，可抑制TMUV的復制[65]。目前無特效的抗病毒藥物來對抗DTMUV感染，而利用降解病毒基因組是一種新的抗DTMUV基因療法。有學者基于DTMUVNS5基因構建了重組腺病毒載體，其高效地抑制了DTMUV的增殖，并對病毒的抑制作用呈劑量依賴性[65]。最新研究發現，Cas13b是一種利用RNA引導靶向和切割RNA分子的CRISPR酶，具有高度的特異性和靶向靈活性，已有報道在哺乳動物和植物細胞中抑制RNA病毒，可能在未來的抗RNA病毒治療中發揮積極的作用[66-68]。利用CRISPR/Cas13b系統構建了靶向PRRSVORF5和ORF7基因的重組載體，在轉基因Marc-145細胞中顯示出很強的抑制效果，同時針對ORF5和ORF7基因的雙crRNA幾乎完全消除了病毒感染[66]，在基孔肯雅病毒的研究中也顯示出強大的抑制病毒增殖效果[69]。

5 展 望

自鴨坦布蘇病毒病疫苗上市以來，病毒的流行和傳播得到了有效的控制，但在全國主要的養鴨地區仍出現零星散發的情況。DTMUV基因組極易發生變異，在易感動物的免疫壓力下發生重組變異，其對病毒的免疫原性、致病性和宿主感染譜均可能發生不同程度的改變。通過對DTMUV毒株全基因組測序分析發現，臨床上出現多株新的變異毒株，而現行的TMUV弱毒疫苗/滅活苗對變異毒株是否具有免疫保護力還未可知，需要進一步的研究。因此，對DTMUV長期進行流行病學調查及遺傳變異分析，為有效、快速地對DTMUV進行防控極其重要。迄今為止，雖然人們對于DTMUV的病原學、流行特點及宿主天然免疫的分子機制進行了研究，但對病毒吸附受體作用詳細機理、不同組織中復制作用的變化情況、抗體干擾病毒的分子作用模式及其他影響機體免疫力的模式尚不完全清楚。此外，研究DTMUV的潛在宿主，徹底消滅潛伏的帶毒感染源，仍是人們所面對的難題，有待進一步研究。