脊椎動物胚胎期脊椎的形成及信號通路調控機制

劉 倩，岳靜偉，牛乃琪，王立賢，張龍超

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所, 北京 100193)

脊椎是哺乳動物整個軀體的框架及支柱，處于背部正中處。脊椎的前體是胚胎發育早期的體節(somites)，體節是在胚胎發育時期沿胚前后軸方向形成的大小相同的重復片段[1]。由于遺傳活動的振蕩波(體節發生波)，體節從前體節中胚層(PSM)順次出現[2]。在哺乳動物絕大多數物種中，體節和脊椎的數量高度保守，豬[3]、羊[4]等哺乳動物的脊椎數存在變異。體節的形成與遺傳振蕩有關，遺傳振蕩似乎是PSM細胞固有的，在該區域由于存在一個體節振蕩器(一系列相關基因的節律性表達域)使得細胞周期化的增殖分化，從而形成一個個體節[5]。體節作為脊椎的前體這一重要結構，在一定程度上決定了椎骨數量，研究它的形成、分化過程及調控通路尤為重要，體節形成后，根據每個區域中體節細胞的位置，它們將分化成生骨節、生肌節和生皮節。體節產生的細胞將構成脊柱、肋骨、皮膚真皮和骨骼肌以及體壁和四肢。Gomez和Pourquié[6]研究報道了控制體節總數的因素：1) 在體節發育過程中對體軸后方生長的控制，在較長的體軸上可以形成更多相同大小的體節；2) 體節大小，在相同大小的體軸上可以形成更多較小的體節。然而具體的體節分節機制尚未可知，研究表明，時鐘波峰模型是被廣泛接受的體節形成模型，而且受多種信號通路的調控[7-9]。振蕩的遺傳時鐘控制著體節這一胚胎結構的發育，該結構產生了保護脊髓的椎骨[10]。脊椎是通過上一個體節后部的生骨節與下一個體節前部的生骨節融合形成的[11]。總之，椎骨總數取決于中胚層體節數，通過研究脊椎的胚胎發育過程、體節分節機制及控制體節總數的因素有利于探索脊椎數變異的調控機制。

1 胚胎發育期脊椎及體節的形成

1.1 脊椎的形成

脊椎是由脊椎動物胚胎發育早期形成的體節發育而來，體節是在胚胎發育時期沿胚前后軸方向形成的大小相同的重復片段[1]。對于高級哺乳動物來說，正常成熟的椎體由受精卵卵裂成多細胞，經過囊胚期進入原腸胚時期。原腸胚包括內胚層、中胚層和外胚層等3個胚層。胚胎中胚層[12]在骨形成蛋白生長因子(BMP)的濃度控制下分化為背部、軸旁、中間、側板和頭部中胚層。軸旁中胚層形成軸旁中胚層帶，在鳥類中稱為體節板，在哺乳類中稱為不分節中胚層，隨著原條退化和神經褶在胚胎中央合攏,軸旁中胚層分隔成細胞模塊，稱為體節[13]。在次級神經胚形成時期，軸旁中胚層所形成的體節是脊椎的前體結構。

體節是脊椎動物在胚胎發育的過程中沿身體前后軸形成一定數目的暫時性結構，但是在組建脊椎動物胚胎的分節模式中非常重要。第一對體節在胚胎前端形成，新體節以規則的間隔從吻端軸旁中胚層萌發。由于胚胎發育速度略有差異，因此，體節數目通常是發育進程最佳指標，所形成體節總數具有種的特異性。隨著胚胎繼續發育形成體節，根據各區體節細胞的位置，體節將分化為生骨節、生皮節和生肌節。生骨節是來自體節的中胚層細胞塊，將分化為脊柱的椎骨軟骨生骨節，隨后發育為脊椎軟骨細胞，進而形成脊椎、肋骨、椎間軟骨及韌帶等結構[14]。脊椎是通過上一個體節后部的生骨節與下一個體節前部的生骨節融合形成的[11]。在兩個胸部椎體之間衍生出左右一對肋骨。因此，體節數越多脊椎數和肋骨數也會越多。

1.2 體節的位置標識

如果胚胎發育過程中體節發育分化出現紊亂，會導致成熟個體脊椎畸形及肋骨融合缺陷。對雞胚的研究[14-15]顯示，體節是由前體細胞群組成的臨時器官，可形成重要的身體結構,體節成對出現在神經管的兩側和胚胎的脊索上。體節板細胞組織形成輪狀，稱為體節小體(somitomere)。隨著最前端的體節小體變成致密結構，體節小體便轉變成體節，它們分化形成相同的細胞類型，由這些細胞形成的結構根據它們在前后軸的位置而發生變化，這點在脊椎的結構中體現最明顯。例如，胸椎含有肋骨，而腰椎和薦椎沒有。這說明體節沿著前后軸具有唯一的位置標識(在軸旁中胚層形成后不久就建立了)。研究表明，時間共線性導致早期脊椎動物發育期間的空間共線性[16]，在早期的雞和斑馬魚胚胎中[17]通過反BMP信號將動態變化的時間共線Hox序列轉換為A-P位置信息的相對穩定的空間共線軸向Hox模式。雞胃中的時間共線性決定了原始條紋細胞遷移到結點的順序[18]，動態變化的原始條紋細胞群體之間發生了相互作用。Hox基因簇在小雞體內的時間共線序列中被激活，但是這些基因在小鼠胚胎中激活的確切時間的信息尚不完整[19]，在雞胚化過程中Hox的時間共線性在發育過程中產生了位置信息(例如前肢位置)[20]。

2 調控體節發育的關鍵信號通路

體節的形成及分化涉及多個基因家族和信號通路，其中包括BMP信號通路、Hox基因家族及其信號通路、Wnt信號通路、FGF信號通路及RA信號通路和Notch信號通路等，這些信號通路及基因通過協同合作對體節的形成進行周期性調控，以確保其正常的形成及分化。

2.1 BMP信號通路

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一大類分泌型生長因子的統稱，BMP以其引起骨分化的能力和與細胞表面受體相互作用的分泌蛋白而得名[21]。BMPR1A是BMP通路的關鍵受體，BMPR1A介導的信號通路對成骨細胞的數量有一定影響。非特異性敲除BMPR1A基因小鼠在胚胎期因中胚層發育受阻引起死亡[22]。Yu等[23]研究發現，骨形態發生蛋白I型受體的抑制會減少異位骨化，使用不同的啟動子于成骨細胞中特異性敲除BMPR1A后可導致骨量增加，而Mishina等[24]研究表明，在小鼠出生后破壞BMPR1A的特異性，會導致突變小鼠的骨量減少，但成骨細胞數量正常，這表明，BMP在包括骨骼發育等多種發育過程中起重要作用。

外胚層中的BMP信號對于預期的軸旁中胚層的正確募集和體節的發育是必需的。BMPR1A編碼骨形態發生蛋白(BMPs)的IA型BMP受體，包括BMP2和BMP4[25]。Miura等[26]在小鼠胚胎(Bmpr-More胚胎)的外胚層中使用BMPR1A的嵌合體失活來評估該基因在中胚層發育中的功能。與不能形成原腸胚的BMPR1A缺失型胚胎不同，Bmpr-More胚胎啟動原腸形成，但預期的軸旁中胚層細胞向原始條紋的募集被推遲。抑制FGF信號可以恢復預期的軸旁中胚層募集的正常時間，促進體節的正常發育。這表明，BMP和FGF信號在近軸向中胚層發育過程中起拮抗作用，促進中胚層的正常發育。研究表明，FGFR3抑制了BMPR1A介導的成軟骨細胞分化，FGFR3誘導骨形態發生蛋白I型受體降解來調節骨骼發育[27]。

2.2 Hox基因家族及其信號通路

同源異型復合基因(Hox)家族在脊椎模式形成和各部分屬性決定過程中發揮了重要作用[28]。Hox基因家族可分為4個簇，即Hoxa、Hoxb、Hoxc和Hoxd，分別位于不同染色體上，每個簇又有13個旁系基因,按順序1～13排列，沿脊椎動物前后軸呈現出重疊的表達區域，形成了“HOX密碼”，為每個椎骨分配屬性形態(圖1)[21,29]。

圖1 Hox基因家族調控脊椎屬性模式示意圖[21]

研究表明，Hox基因家族基因Hoxc8、Hox9、Hox10和Hox11均與脊椎骨同源異型轉變相關。Hox基因在前后軸之間形成圖案，并有助于確定沿該軸的位置。如果敲除Hox基因，可能會出現特定片段的畸形。同樣，引起Hox基因異位表達可以改變體軸。Hoxc8在小鼠體內的表達失控會導致幾種骨骼缺陷，如胸椎的同源異型轉化和肋骨發育異常。Hoxc8控制最后一根胸椎的正常發育，刪除Hoxc8的關鍵增強子會導致小鼠第一腰椎轉化成額外的一節胸椎，相應的增加一對肋骨數。在胚胎晚期和出生后，Hoxc8通過調節BMP和Wnt信號通路中的關鍵基因參與成骨細胞的分化[30]。Hox9具有抑制肋骨過度發育的功能，敲除小鼠的Hox9基因，脊椎總數無變化，但是肋骨數明顯增加。小鼠在沒有Hox10基因功能的情況下，不會形成腰椎，取而代之的是從最后一節胸椎到薦椎均生出左右肋骨。在沒有Hox11基因功能的情況下，不形成薦椎，并且這些椎骨轉化成腰椎(圖2)[31-32]。Hox基因的表達受其上游FGF、Wnt、Notch和RA等信號通路的調控[11,33]。

圖2 同源Hox軸向骨架表型的示意圖[32]

2.3 Wnt信號通路

Wnt信號傳導途徑是由配體蛋白質Wnt和膜蛋白受體結合激發的一組多下游通道的信號轉導途徑。經此途徑，通過細胞表面受體胞內段的活化過程將細胞外的信號傳遞到細胞內。在調控體節形成方面，Wnt信號通路主要與Notch信號通路相互影響。椎骨源于前體節中胚層(PSM)分割產生的體節。Aulehla等[34]建立了Wnt/β-catenin信號和分節時鐘之間的新型連接。Wnt通路的負調控因子Axin2直接受Wnt/β-catenin的控制，即使在Notch信號受損的情況下，PSM也會在LSMng表達中振蕩表達。此外，Wnt3a是在PSM中振蕩Notch信號活動所必需的，該研究表明，分節時鐘是通過Wnt/β-catenin信號經由負反饋機制建立的，并且Wnt3a會控制脊椎動物的分節過程。當Wnt3a發生突變時，會影響體節分節，Wnt通路的負調控因子Axin2的表達相應降低。Chu等[35]從人類胚胎干細胞衍生的分節時鐘模型在體內顯示了哺乳動物分節時鐘的許多標志，包括對Notch和Wnt信號通路的依賴性。Wnt的激活和轉化生長因子β(TGF-β)的抑制是傳播HES7振蕩所必需的。這些結果表明，在發育中的新生人類體節中，TGF-β信號通路下調[36]。

2.4 FGF信號通路

成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)是一個18種分泌配體的家族[37]，它可以促進中胚層細胞的生長，與體軸的建立和體節的形成等有關。中胚層定期切成體節(椎骨的前體)是由分子鐘控制的，該鐘在小鼠胚胎中存在FGF通路活性的超周期振蕩(周期約2 h)[38]。Dubrulle等[39]研究表明，FGF8在后PSM中的表達產生了一個可以確定體節的邊界位置和軸向同一性的移動波前，FGF8信號還可以影響體節的大小，呈負反饋調節。此外，通過控制雞胚的邊界位置發現，Hox基因的表達維持在適當編號的體節上，而不是絕對的軸向位置。這些結果表明，FGF8在確保分節過程和時空Hox基因激活的緊密協調中起作用，同時，FGF信號通路對體節分節的調控是通過與Notch、Wnt等信號通路共同作用完成的。Naoki等[40]發現，PSM中的形態發生子梯度起波前作用，其中，FGF和Wnt信號產生的梯度在前PSM處減弱，并隨著尾巴伸長而不斷向后端移動。

2.5 RA信號通路

RA(視黃酸)指的是維生素A的體內活性代謝產物，可以調控基因表達，與神經系統的發育、體節的左右對稱發生和脊椎動物體軸的延伸相關。研究表明，將小鼠妊娠第8天的胚胎暴露于RA中，第一或第二個腰椎被轉變成胸椎(肋骨)，而第一個薦椎通常變成腰椎。這些結構變化與Hox基因表達的位置相關。當Hoxa-10的表達向后移動，將會在第一節腰椎上形成額外一對肋骨[41]。Kawakami等[42]通過描述斑馬魚的胚胎發育，表明了阻止RA信號(在它到達側板中胚層之前)會導致隨機的左右不對稱的體細胞。此外，揭示了一種由RA信號介導的機制，阻斷RA信號或RA敲降后，會打破斑馬魚體節左右對稱生成的模式，但RA信號的下降會影響6～13體節，從而表明，RA對兩側對稱的體細胞發生方面起著至關重要的作用。Vermot和Pourquié[43]在雞胚中研究報道，阻斷雞胚中RA的產生導致兩個胚胎兩側的體節形成不同步，這表現在一個縮短的左節段區域。該缺陷與分節時鐘振蕩的協調丟失有關。在缺乏RA的雞或小鼠胚胎[44]中，位置反轉會導致體細胞發生偏側缺陷的反轉。RA以時間特定的方式調節對Wnt和BMP的響應，RA信號對于前腸祖細胞響應Wnt和BMP信號激活呼吸命運至關重要[45]。

2.6 Notch信號通路

Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，在進化上高度保守，在神經細胞的分化、脊椎動物體節的發育等過程中具有重要作用。Notch通路內基因的周期性表達是體節正常發育所必需的。Keskin等[46]研究表明，脊椎動物分節時鐘控制著脊柱的精確時空模式。通過計數斑馬魚中的分節時鐘基因的單個轉錄物表明，時鐘基因具有較低的RNA幅度，并且表達變異性主要是由基因外源驅動的，而Notch信號通路則抑制了這種表達。Notch信號傳導在控制體節從增殖到分化的轉換中都起著至關重要的作用。Hes/her的家族基因是Notch信號傳導的直接靶標。Carrieri等[47]通過先天性脊柱側凸連鎖分析顯示6個基因(DLL3、MESP2、LFNG、HES7、TBX6和RIPPLY2)的突變，其中4個是Notch通路的組成部分(DLL3、MESP2、LFNG、HES7)，Notch對小鼠的分節過程至關重要，因為在沒有Notch信號的情況下，分節時鐘停止并且沒有9突節。在PSM的單個細胞水平上，通過不穩定時鐘基因產物的正反饋和負反饋回路來建立振蕩時鐘基因表達，會增強或抑制激活它們的通路。相鄰細胞之間時鐘基因振蕩的同步依賴于Notch信號10、11、12和13。其他與體節相關的通路內基因對Notch通路信號也會產生影響，如FGF及Wnt通路。

3 體節形成的經典模型

研究表明，體節分節模型包括時鐘波峰模型(clock and wavefront model)[48]、反應擴散模型(reaction-diffusion type model)[49]、沿PSM移動的細胞決定波(wave of cell determination)[50]和時鐘誘導模型(clock and induction model)[51]等。但是部分模型具有一定的局限性，時鐘波峰模型是目前被廣泛接受的體節形成模型。

3.1 時鐘波峰模型

體節的形成具有嚴格的節律性，稱為分節時鐘。是由時鐘基因Hes7(一種Hes家族轉錄因子)的周期性表達以及形態素Notch、FGF、Wnt、RA等的濃度梯度決定的周期性激活[48,52-53]，這種周期性被歸納為時鐘波峰模型，由時鐘和波前信號組成，時鐘信號提供周期性定時的時間信息，而波前信號提供恒定距離的空間信息，當時鐘和波前信號相遇時，PSM單元開始分化成體節。PSM細胞中的時鐘基因振蕩通過Delta-Notch信號同步[54]。體節的空間周期性來源于PSM中振蕩基因表達的時間周期性。體節分割間隔因物種不同而異，例如，小鼠為120 min，雛雞為90 min，斑馬魚為30 min[55]，人類約5 h[56]。這些時間間隔與時鐘基因的振蕩周期一致：小鼠中的時鐘基因是Hes7和Lfng[1]，在小鼠胚胎中，此周期性受分段時鐘基因Hes7的控制，該基因在PSM中表現出波狀振蕩表達[57]。雛雞中是Hairy1和Hairy2，斑馬魚中是Her1和Her7和DeltaC(Notch配體)。Cooke 和Zeeman[9]提出，時鐘波峰模型是目前被廣泛接受的體節形成模型，后來被試驗確定為分節時鐘[58]，分節時鐘(圖3)作為一種分子振蕩器控制著脊椎動物的體細胞發生[59]。體節的周期性生成與前體節中胚層中同步基因表達的振蕩模式密切相關，這種基因表達的模式即分節時鐘。這種模型受到多種信號通路的共同調節，這些通路中的基因形成一個周期性表達的沿前體節中胚層傳遞的表達波譜，共同影響體節的延長和分節。當決定前沿經過前體節中胚層細胞后，該區域的前體節中胚層細胞就可以應答分節時鐘傳遞的周期性分節信號[39]。以脊椎動物的分節為例，Goldbeter等[60]論證了RA和FGF沿卵裂期前中胚層(PSM)的拮抗梯度可能導致兩個穩定的穩態共存。該研究認為，這種雙穩態與FGF和RA信號水平的突變有關，這允許PSM細胞連續隊列中的分節基因(如mesp2)響應于分節時鐘而同步激活，從而影響體節的分節。研究表明，RA受體與其配體基因在軸旁中胚層顯著表達，對體節形成過程中的分節時鐘和Hox基因的表達模式進行調控。RA和FGF相互抑制產生的雙穩態為時鐘和波前體節發生模型中假定的全部或沒有過渡提供了分子機制。鑒于相互對立的信號梯度在發育中很常見，因此，這種雙穩態開關可能代表了胚胎模式背后的重要原理[60]。細胞通過激活片段寬域中的MESP基因來響應來自片段時鐘的周期性信號[61]，MESP基因的表達受到高FGF信號的抑制[62]，并且需要RA信號才能轉錄，從而解釋了它們在決定前沿水平的限制表達[63]。

上圖：PSM中Hes/Her基因的表達動態和Fgf/Wnt梯度。在神經管的兩側周期性地形成體節。左下圖：Hes/Her基因在PSM中顯示出振蕩表達。右下圖：Hes/Her基因的振蕩是由細胞自主的負反饋回路驅動的，并通過Delta/Notch信號與細胞間相互作用耦合

3.2 時鐘基因Hes7的周期性表達

分節時鐘控制著體節的周期性形成，體節是沿著身體軸線重復的結構，形成脊椎和肋骨。在體節分割過程中，時鐘基因(如Hes7)的表達在早熟中胚層(PSM)中同步振蕩。該同步振蕩在前PSM處減慢，導致從后PSM到前PSM呈波狀傳播，這種動態表達取決于Notch信號傳導，并且對于形成體節至關重要[64]。Sparrow等[65]研究表明，這個時鐘系統的核心是Hes或Her基因(Hes7)的周期性表達，同時是PSM中Notch、FGF和Wnt信號通路的周期性激活[66-67]。Yoshioka-Kobayashi等[1]研究表明，個體的細胞活動是波動的但又不斷地通過細胞-細胞耦合在種群水平上不斷協調。典型的例子是體節分節時鐘，其中時鐘基因(如Hes7)的表達在組成分裂前中胚層的細胞之間同步振蕩。這種同步化依賴于Notch信號通路；抑制這一通路會使振蕩失去同步性，導致體節融合3～7節。Hubaud等[68]證明，PSM細胞可以以靜止狀態存在，并且可以響應于涉及Notch和Yap信號的細胞密度相關信號而切換到振蕩狀態。該研究發現了可激發振蕩器模型，該模型超出了先前假定的耦合相位振蕩器的范圍，并成為分節時鐘的更通用模型。在小鼠PSM中，轉錄阻遏物Hes7的表達同步振蕩，像行波一樣從后部傳播到前部區域，并且每個波都導致體節分節[69-70]。Hes7振蕩受延遲的負反饋調控：Hes7蛋白在延遲的時間抑制其自身的表達，而這種抑制作用下調Hes7的蛋白表達，從而導致表達重新激活[71-72]。Hes7的表達缺失和穩定表達都會導致嚴重的體節融合[73-74]，而更快的Hes7振蕩會加速分節的速度[75]，表明Hes7振蕩是小鼠分節時鐘的基礎。總之，Hes7基因缺失會導致體節分割紊亂，且其前后極性被破壞，諸如椎骨和肋骨之類的松節體衍生物嚴重地雜亂無章，因此Hes7基因對于協調節段分割至關重要。盡管進行了如此深入的研究，但振蕩動力學的確切機理仍有待分析。例如，Hes7振蕩在相鄰的PSM單元之間同步，但是同步的確切機制未知。

4 展 望

探索脊椎的胚胎發育過程對脊椎數變異的研究有很大的幫助，目前研究表明，椎骨總數取決于中胚層體節數，體節數又受BMP、Hox、Notch、Wnt、FGF及RA信號通路調控。然而，脊椎動物體節的具體調控機制仍然未知，目前只有研究表明，Hox基因是調節體軸生長的候選基因，是脊椎各部分的形態屬性的決定因子，體節數量固定后，脊椎模式的形成可由Hox基因的表達調控。把Hox基因表達圖式和不同類型脊椎動物比較, 可以看出，脊椎動物類型是由Hox在體節中的表達格局(constellation)決定的。對于體節的具體影響因素和調控機理以及體節影響脊椎數變異的機理仍需要進一步研究。