益艾康膠囊聯合HAART對HIV感染者外周血和Th1/Th2細胞因子的影響*

李 杰，岳靜宇，鄧博文，桑 鋒，劉 真，李 強，郭會軍

(河南中醫藥大學第一附屬醫院艾滋病臨床研究中心，河南 鄭州 450000)

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)自從20世紀80年代開始大流行以來，已奪走了超過3 500萬人的生命[1]。截至2019年10月底，我國現存活HIV感染者約95.8萬例，死亡15.4萬例，有效預防與治療艾滋病、控制疾病傳播成為亟待解決的問題[2-3]。高效抗逆轉錄病毒治療(highly active anti-retroviral therapy，HAART)可有效抑制病毒核酸，但藥物存在交叉耐藥性、不良反應大等問題。中藥具有多系統、多環節、多靶點調控的特點，在預防和治療復雜、慢性疾病方面有獨特優勢。益艾康膠囊是國家中醫藥治療艾滋病試點項目制劑，由人參、黃芪、炒白術、茯苓、當歸、川芎、白芍、黃芩等中藥組成，具有益氣健脾、化濕解毒之功效。2004年至今，益艾康膠囊已累計救治4 586例人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染者，取得了較好的臨床療效。研究[4-5]表明：多種免疫細胞及其分泌的細胞因子參與了艾滋病發病機制和疾病進展，并和血漿 HIV 病毒載量及外周血 CD3+、CD4+、CD8+T細胞數量有關。益艾康膠囊作為一種加強抗 HIV 病毒效果輔助治療艾滋病的藥物[6-7]，可能通過影響這些細胞因子從而在AIDS治療過程中起重要作用。本研究對河南部分地區HIV感染者給予益艾康膠囊聯合HAART后9種Th1/Th2細胞因子、T細胞亞群和病毒載量的變化及相關性進行探討，現報道如下。

1 研究對象

以河南中醫藥大學第一附屬醫院艾滋病臨床研究中心HIV感染者血液樣品庫為依托，篩選已使用HAART預加服中藥益艾康膠囊治療患者30例，年齡18～60歲，其中男22例，女8例。符合如下條件：①HIV抗體證實陽性的感染者；②18<年齡<60歲，能配合研究者；③簽署知情同意書，自愿受試者；④排除合并嚴重心、肝、腦、腎等原發性疾病者；⑤嚴重精神疾病者；⑥妊娠或哺乳期婦女及對中藥制劑過敏者。

2 藥 物

益艾康膠囊(由河南省中醫藥研究院附屬醫院制劑室生產，產品批號20160624，0.5 g/粒)，5粒/次，3次/d，溫開水送服。參照《中醫藥治療艾滋病臨床技術方案(試行)》[8]及《河南省中醫藥治療艾滋病常見病癥辨證治療要點》[9]，根據患者癥狀、體征、脈象、舌象等信息進行中醫辨證論治。

3 試劑與儀器

人Th1/Th2細胞因子檢測試劑盒(Pro Human Cytokine Th1/Th2 Panel，9-plex)，批號 5028196，規格 96 T，伯樂(Bio-Rad)公司生產；人類免疫缺陷病毒(Ⅰ型)核酸檢測試劑盒(COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test，v2.0)，批號 E33143，規格 48 T，羅氏(Roche)公司生產；絕對計數管(TruCOUNT tube)，批號 9263343，規格 50 T，BD公司生產；熒光單克隆抗體試劑盒(CD3-FITC/CD4-PE/CD45-PerCP/CD8-APC)，批號 61872，規格 50 T，美國BD公司生產；流式細胞溶血素(FACS 溶血素)，批號 6204937，規格100 mL，美國BD公司生產。

高通量細胞因子檢測系統，型號 Bio-Plex 200，Bio-Rad公司生產；全自動病毒載量儀，型號 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan，Roche公司生產；流式細胞儀，型號BD FACSCalibur，美國BD公司生產。

4 方 法

4.1 分組與研究方法

分別于治療前、治療6個月、治療1年時，采用抗凝管(EDTAK2)采集益艾康膠囊聯合HAART患者肘靜脈血，并分離血漿，檢測細胞因子和T細胞亞群。病毒載量僅檢測治療前和治療1年時。

4.2 Th1/Th2細胞因子檢測

血漿樣品用樣品稀釋液稀釋4倍，細胞因子標準品用標準品稀釋液稀釋系列濃度(8個)，微珠、檢測抗體和PE標記鏈霉親和素(Streptavidin-PE)分別用分析緩沖液、抗體稀釋液和分析稀釋液稀釋成1×使用液，實驗操作按照試劑說明書進行。檢測的細胞因子包括：白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。高通量細胞因子檢測系統開機后，分別使用2種校準試劑(Calibration和Validation)校正儀器，將處理后的96孔板上機檢測，流式熒光法掃描檢測結果，檢測結果單位為ng/L。

4.3 HIV核糖核酸檢測

取1 mL血漿加入樣本管(S-tube)中，將樣本管置于樣本架上加載至儀器，加載試劑與耗材樣本處理單元(SPU)、K-槍頭(K-tip)和K-管(K-tube)，采用全自動病毒載量儀檢測血漿病毒載量。檢測方法為Real-time PCR定量檢測血漿中HIV核酸量，擴增的靶區域為 HIV 結構基因gag 區。試劑為內標法，設有陰性、弱陽性和強陽性質控品各1個。檢測范圍20～1×107copies/mL。

4.4 T淋巴細胞亞群檢測

TruCOUNT tube中加入20 μL CD3-FITC/CD4-PE/CD45-PerCP/CD8-APC混合抗體，再加入50 μL全血樣品，振蕩混勻，室溫18～25 ℃,避光孵育20 min，然后加入1×FACS溶血素450 μL，混勻室溫避光孵育20 min后用流式細胞儀上機檢測，采用多色分析軟件以CD45+設門，記錄CD3+T、CD4+T、CD8+T細胞數。

4.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件分析數據，采用配對樣本t檢驗對9種細胞因子、CD3+T、CD4+T和CD8+T細胞3次結果均數進行比較；采用多元回歸模型分析9種細胞因子與病毒載量、T淋巴細胞亞群的相關性。檢驗水準α=0.05。

5 結 果

5.1 隨著治療時間增加,9種Th1/Th2細胞因子變化對比

與同組治療前對比，兩組IL-2、IL-4、IL-5等9種細胞因子在益艾康聯合HAART 6個月、1年時均升高，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 隨著治療時間增加HIV感染者外周血中9種Th1/Th2細胞因子變化對比

5.2 隨著治療時間增加,T淋巴細胞亞群對比

CD3+T和CD8+T細胞計數在治療6個月和治療1年時與治療前對比，差異無統計學意義(P>0.05)。CD4+T細胞計數治療6個月與治療前對比，差異無統計學意義(P>0.05)；但治療1年時與治療前對比，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 隨著治療時間增加HIV感染者外周血中T淋巴細胞亞群對比

5.3 多元回歸模型分析治療1年前后病毒載量與9種細胞因子2次結果均數之間的相關性對比

回歸分析結果中ANVOA(方差分析)顯示：F=2.11，P=0.048，回歸模型有相關性。相關性分析結果顯示：IL-2(r=0.25，P=0.03)、IL-10(r=0.28，P=0.01)、IL-13(r=0.27，P=0.02)和TNF-α(r=0.22，P=0.04)分別與病毒載量有低度正相關性關系(P<0.05)。見表3。

表3 多元回歸模型分析益艾康膠囊治療HIV感染者1年前后病毒載量與9種細胞因子2次結果均數之間的相關性對比 n=30

5.4 9種細胞因子與T淋巴細胞亞群的相關性

相關與回歸分析結果均顯示：隨著CD4+T細胞升高，TNF-α有增加趨勢，其余細胞因子有下降趨勢；CD3+T和CD8+T細胞與9種細胞因子變化趨勢一致，但無相關性(P>0.05)。

6 討 論

研究發現：多種免疫細胞及其釋放的細胞因子參與了HIV/AIDS的發病機制，并和血漿HIV病毒載量相關[4]。CD4+T細胞起初是根據其細胞因子分泌模式來定義的。Th1應答產生IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α等，驅動細胞免疫反應控制細胞內病原體；Th2應答產生IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細胞因子，促進體液反應控制細胞外病原體。隨著研究的不斷深入，發現這些細胞的某些功能和產生的細胞因子存在重疊[10-11]。在早期的HIV感染中，上述細胞因子風暴主要由促炎性細胞因子反應組成，與Th1反應一致。這些細胞因子中的某些具有抗病毒活性，如IFN-γ可以增強先天和適應性細胞免疫應答，但強烈的早期細胞因子反應可能會促進病毒復制和免疫病理[10]。

《醫權初編》云：“氣聚則生，氣壯則康，氣衰則弱，氣散則亡。”“氣虛”是艾滋病的基本病機，氣對機體的生理、病理，以及病情變化起著重要的作用[12]。《黃帝內經》云：“正氣存內，邪不可干。”“邪之所湊，其氣必虛。”在這里，“氣”指機體的免疫功能。艾滋病病因中外因為感染溫邪疫毒，內因為正氣受損，精氣不足，氣血虧虛。結合辨證論治給予合適的中藥治療可以將正氣調節到正常的水平[13]。本研究觀察了患者在中藥復方益艾康膠囊聯合HAART后1年內3次Th1/Th2細胞因子的檢測結果，發現中西醫聯合治療半年和1年后，細胞因子水平均較治療前有所升高，9種細胞因子均在治療半年后明顯升高，治療1年后逐漸降低，體現了中藥治療的整體觀念，表明中藥對免疫因子的調節是雙向的。外邪入侵激活機體免疫細胞，改變細胞因子水平；但艾滋病的主要特征是持續低水平的異常免疫激活[14]，強烈的細胞因子風暴也會對機體造成損傷。因此，不同程度地矯正這些細胞水平可影響免疫應答過程，進而影響AIDS疾病進展。在治療1年后，患者的CD4+T細胞計數明顯升高，與治療前對比差異有統計學意義(P<0.05)，進一步表明中西醫結合治療能夠提高CD4+T數量，有利于免疫功能重建。對這些細胞因子與病毒載量進行回歸分析，發現IL-2、IL-10、IL-13和TNF-α與病毒載量有低度正相關性關系，表明適度降低這些細胞因子水平，可能有助于抑制病毒核酸，其具體機制需進一步深入研究。