朱砂葉螨各發(fā)育階段內(nèi)參基因評估及篩選

倪 婧，謝道燕，江秀均，楊振國，柴建萍

（云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101）

熒光定量PCR技術（qRT-PCR）因定量準確、靈敏度高、重現(xiàn)性高等優(yōu)點，成為基因表達差異檢測、基因分型、甲基化檢測、基因表達水平等研究中的重要技術手段，但該技術在操作過程中對樣品RNA質(zhì)量、純度要求較高，為減少不同樣品間提取的RNA質(zhì)量、純度、反轉(zhuǎn)錄效率等操作過程中的誤差，在qRT-PCR試驗中還需引入一個或幾個表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為參照物對表達結(jié)果進行校正和標準化處理［1，2］，因而引入的內(nèi)參基因在試驗樣品中的表達穩(wěn)定性決定基因定量結(jié)果的準確性。

理想的內(nèi)參基因應符合以下幾個條件：在生物體內(nèi)表達量適中；表達水平與生物體內(nèi)細胞周期及細胞活化與否無關；在生物體內(nèi)不同類型組織細胞、不同生長發(fā)育階段表達量都相對恒定，無顯著性差異；且不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，均能穩(wěn)定表達。目前常用的內(nèi)參基因有延伸因子1（elongation factor-1 alpha，ELFn）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、琥珀酸脫氫酶復合體A亞基（succinate dehydrogenase complex subunit A，SDHA）、α微管蛋白（tubulin alpha-1 chain，α-tubulin）、β-肌動蛋白（β-Actin）、5.8S核糖體RNA（5.8Sribosomal RNA，5.8SrRNA）等基因［3，4］。常用的內(nèi)參基因雖然均能在生物體內(nèi)穩(wěn)定表達，但并非所有內(nèi)參基因都完美的適用于任何生物體，因此在不同的生物樣本及特定試驗條件下，要得到準確的定量結(jié)果，科學篩選內(nèi)參基因以最優(yōu)選擇匹配試驗是非常必要的［5-7］。

朱砂葉螨是世界重大害螨之一，危害農(nóng)林作物范圍較廣，對噠螨靈、樂果、阿維菌素、毒死蜱、甲氰菊酯、敵敵畏、辛硫磷等多種常用藥劑產(chǎn)生了較高的抗藥性。有研究表明，朱砂葉螨抗甲氰菊酯品系中最理想的內(nèi)參基因為RPS18和5.8S rRNA基因組合，而在卵、幼螨、若螨和成螨4個不同螨態(tài)中則為RPS18和α-TUB基因組合［8，9］。二斑葉螨抗甲氰菊酯品系α-TUB基因最穩(wěn)定［10］，在抗季酮酸類品系中Ubiquitin和β-actin基因為最適內(nèi)參基因［11］，在抗阿維菌素品系中最佳內(nèi)參基因為ELFn［2］；柑橘全爪螨在不同藥劑選擇壓力和外界脅迫下，最理想的內(nèi)參基因組合為ELFn和GAPDH［12］。炔螨特曾被認為是安全、低毒、高效且不易產(chǎn)生抗藥性的藥劑，但在近年的研究中發(fā)現(xiàn)各地區(qū)各植物上的朱砂葉螨對炔螨特也表現(xiàn)出不同程度的抗藥性，對炔螨特抗藥性的相關分子機制研究需要用到熒光定量PCR技術，但對炔螨特抗藥性的朱砂葉螨品系及各發(fā)育階段的最佳內(nèi)參基因無直接參考依據(jù)。本研究利用geNorm軟件，對朱砂葉螨敏感品系及抗炔螨特品系各發(fā)育階段中6個常用內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行評估，篩選出各品系、各發(fā)育階段的最佳內(nèi)參基因，為以后開展朱砂葉螨對炔螨特抗藥性相關分子機制研究選擇內(nèi)參基因提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試朱砂葉螨

朱砂葉螨敏感品系采自重慶市北碚區(qū)田間，在人工氣候室內(nèi)［（25±1）℃，60%～80%RH，L∶D=14 h∶10 h］持續(xù)用新栽無蟲豇豆苗（Vigna sinensis）繼代飼養(yǎng)多年，不噴施任何藥劑，作為相對敏感品系。

朱砂葉螨抗炔螨特品系：從上述敏感品系中分離出部分朱砂葉螨作為起始材料，以炔螨特為選擇藥劑，在人工氣候室內(nèi)［（25±1）℃，60%～80%RH，L∶D=14 h∶10 h］噴施炔螨特，連續(xù)多代選育出對炔螨特有較強抗性的朱砂葉螨。

1.2 主要試劑盒

RNeasy Plus Micro Kit，PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time，SYBR?Premix Ex TaqTMII。

1.3 方法

1.3.1 朱砂葉螨敏感品系和抗炔螨特品系各發(fā)育階段供試螨獲取 參照葉碟法并加以改進飼養(yǎng)各發(fā)育階段的朱砂葉螨，取7～10 cm的培養(yǎng)皿若干，把濾紙剪成直徑6～8 cm大小的圓形紙碟，在培養(yǎng)皿內(nèi)先鋪上適當大小的脫脂棉，再把濾紙平鋪在脫脂棉上，加清水至飽和，將新栽的無蟲豇豆苗葉片剪成直徑5.0 cm大小，背面朝上正面緊貼濾紙平鋪，形成孤島狀，防止葉螨逃離。分別將敏感品系和抗炔螨特品系3～5日齡的活潑雌成螨用毛筆挑至葉蝶上，每個葉蝶接入40～50頭雌成螨，置于（25±1）℃、RH 60%～80%、光照周期14L∶10D的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，產(chǎn)卵24 h后移除葉蝶上的雌成螨，依次收集不同發(fā)育階段的螨。

卵的收集：產(chǎn)卵后待卵發(fā)育至3日齡時，用毛筆輕輕挑取約4 000粒卵于1.5 mL離心管中，用于RNA的提取。

幼螨的收集：部分卵留在葉蝶上繼續(xù)孵化為黃白色，3對足幼螨，孵化后12 h內(nèi)用毛筆挑取活動期的幼螨約2 500頭至1.5 mL離心管中，用于RNA的提取。

若螨的收集：剩余幼螨繼續(xù)在葉蝶上發(fā)育1 d成為4對足若螨（1齡若螨），用毛筆挑取約1 000頭于1.5 mL離心管中，用于RNA的提取。

雌成螨的收集：剩余若螨再經(jīng)過3 d發(fā)育為成螨（3日齡），用毛筆挑取約200頭雌成螨于1.5 mL離心管中，用于RNA的提取。

1.3.2 實時熒光定量PCR內(nèi)參基因引物設計 參照孫偉［9］和高新菊［10］設計的內(nèi)參基因引物，其中6個常用的內(nèi)參基因備選（表1）。

表1 朱砂葉螨內(nèi)參基因qRT-PCR引物序列

1.3.3 朱砂葉螨兩個品系各發(fā)育階段總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 使用Qiagen公司RNeasy Plus Micro Kit試劑盒提取敏感品系和抗炔螨特品系卵、幼螨、若螨、雌成螨總RNA，并進行質(zhì)量檢測。使用TAKARA公司PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA合成第一鏈cDNA。

1.3.4 內(nèi)參基因引物熔解曲線分析及標準曲線建立 熔解曲線和標準曲線是判斷設計合成的引物是否具有特異性及較高擴增效率的重要指標。

熔解曲線分析：以敏感品系雌成螨cDNA為模板，在實時熒光定量PCR儀中進行內(nèi)參基因引物熔解曲線擴增，試驗設3次技術重復，溫度以0.5℃∕10 s的速度從60℃緩慢遞增到95℃，連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線，熔解曲線為單峰且單峰前后無其他雜峰出現(xiàn)時對應的引物特異性強，無引物二聚體形成，無非特異性擴增。

標準曲線建立：以敏感品系雌成螨cDNA為模板，呈3倍梯度將模板稀釋為4個濃度（30、3-1、3-2、3-3），將熔解曲線為單峰的內(nèi)參基因引物在實時熒光定量PCR儀上進行試擴增，每個濃度梯度內(nèi)設3個技術重復，對照為滅菌蒸餾水。結(jié)果以相對拷貝數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標建立相對定量標準曲線，當Ct值在15～30，斜率為-3.3±0.3，擴增效率在90%～110%，決定系數(shù)R2＞0.99時，說明該引物擴增性較好，可用于后續(xù)試驗。實時熒光定量PCR反應體系按照SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說明書在冰上配制。

1.3.5 內(nèi)參基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測 分別以朱砂葉螨敏感品系和抗炔螨特性品系的卵、幼螨、若螨和雌成螨cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR檢測，滅菌蒸餾水為對照。實時熒光定量PCR反應體系按照SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒說明書在冰上配制。

1.3.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價 使用geNorm軟件計算6個內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度的平均值M，M值越小，該內(nèi)參基因表達越穩(wěn)定，再通過標準化因子配對差異分析（Vn∕n+）l來確定最適內(nèi)參基因數(shù)目［13，14］，ge-Norm軟件以0.15為默認閾值，當Vn∕n+l＜0.15時，說明沒必要使用數(shù)量大于n+l個內(nèi)參基因［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 朱砂葉螨兩個品系各發(fā)育階段總RNA純度測定和質(zhì)量檢測

用微量核酸蛋白質(zhì)濃度測定儀測定RNA濃度和純度，結(jié)果顯示（表2），所有提取的RNAOD260∕280在1.89～2.20，OD260∕230在1.95～2.31，說明提取的朱砂葉螨兩個品系各發(fā)育階段的RNA完整性好，可作為實時熒光定量PCR反應模板。

表2 各RNA純度信息

對RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示（圖1），28S與18S條帶清晰，無拖帶，且亮度比約為2∶1，5S條帶較淡或幾乎不見，說明RNA降解較少，質(zhì)量好，可滿足后續(xù)試驗要求。

圖1 朱砂葉螨不同品系和不同螨態(tài)總RNA電泳

2.2 內(nèi)參基因引物熔解曲線及擴增效率分析

內(nèi)參基因熔解曲線顯示（圖2），6個內(nèi)參基因引物熔解曲線均為尖銳單峰，且單峰前后無其他雜峰，說明無非特異性擴增，無引物二聚體形成。標準曲線顯示（表3，圖3），6個內(nèi)參基因重復性好，Ct值均在15～30，標準曲線方程斜率為-3.3±0.3，擴增效率為92.125%～96.588%，決定系數(shù)R2均大于0.99。以上檢測結(jié)果說明合成的6個內(nèi)參基因引物特異性好，符合熒光定量PCR要求。

圖3 朱砂葉螨內(nèi)參基因qRT-PCR標準曲線

表3 朱砂葉螨內(nèi)參基因qRT-PCR引物擴增效率

圖2 朱砂葉螨內(nèi)參基因qRT-PCR引物擴增產(chǎn)物的熔解曲線分析

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性評估

geNorm軟件計算出兩個品系6個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度為（表4，圖4）RPS18＞α-TUB＞SDHA＞5.8SrRNA＞GAPDH＞ELFn，軟件評估結(jié)果顯示，兩個品系間RPS18與α-TUB內(nèi)參基因組合表達穩(wěn)定度較高；不同發(fā)育階段6個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度為（表4，圖5）α-TUB＞GAPDH＞RPS18＞5.8S rRNA＞SDHA＞ELFn，軟件評估結(jié)果顯示不同發(fā)育階段α-TUB與GAPDH內(nèi)參基因組合表達穩(wěn)定度較高。

圖4 朱砂葉螨兩個品系候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

圖5 朱砂葉螨不同螨態(tài)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

表4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的評估結(jié)果

geNorm軟件標準化因子配對差異分析（Vn∕n+）l得出的比值顯示，兩個品系中V2∕3=0.07（圖6），不同發(fā)育階段V2∕3=0.112（圖7），均小于0.15的閾值，其余比值均大于0.15，說明沒必要選擇超過2個的內(nèi)參基因參與試驗，所以在兩個品系及不同發(fā)育階段不多于2個內(nèi)參基因作為參照最適合。

圖6 朱砂葉螨兩個品系多內(nèi)參參數(shù)P值

圖7 朱砂葉螨不同螨態(tài)多內(nèi)參參數(shù)P值

3 討論

所有基因包括內(nèi)參基因在生物體不同類型的組織、細胞、不同發(fā)育時期、不同試驗條件下均存在表達差異，所以內(nèi)參基因的選擇并非一勞永逸的事，而是需要根據(jù)特定的生物樣本及特定的試驗條件進行選擇。本試驗通過geNorm軟件篩選出朱砂葉螨敏感品系及抗炔螨特品系RPS18和α-TUB基因為最佳內(nèi)參組合，在卵、幼螨、若螨、雌成螨4個發(fā)育階段α-TUB和GAPDH基因為最佳內(nèi)參組合，為后續(xù)研究朱砂葉螨對炔螨特抗藥性分子機制等相關研究選擇理想內(nèi)參基因提供參考。