透明與否對離心沉降式宮頸液基薄層細胞制片質量的影響

劉 丹，劉盛均，陳 楊

（綿陽市中心醫院病理科 四川 綿陽 621000）

宮頸癌是我國女性生殖系最常見的惡性腫瘤疾病，嚴重危害女性身體健康，宮頸細胞學篩查在預防子宮頸癌方面發揮著重要作用，液基薄層細胞學（TCT）檢查作為宮頸細胞學篩查的首選辦法，能有效對宮頸癌進行早期篩查，因此制備一張合格的涂片對最后的診斷至關重要，本文將針對透明與否對染色質量的影響進行探討。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2020年4月—9月婦科及體檢科送檢的宮頸細胞學標本500例。

1.2 方法

1.2.1儀器及試劑 廈門邁威生物液基細胞檢查系統，MCT-2000液基薄層細胞制片機、旋渦振蕩器、制片器。液基細胞保存瓶、細胞提取液、細胞固定液（95%乙醇）、巴氏染液、蘇木素、0.5%鹽酸酒精、無水乙醇、環保透明劑、中性樹膠、一次性吸管、蓋玻片。

1.2.2液基薄層細胞學涂片的制備 每例標本均同時制備兩張涂片分別標記A和B。具體操作如下：取回的細胞標本按患者姓名、編號進行登記，并在載玻片一端標記患者編號；將采集有細胞標本的保存液瓶放在振蕩器上混勻5 min左右，注意擰緊瓶蓋防止液體溢出造成污染；往制片器的沉降管中加入細胞提取液至刻度線（約3.5 mL）使過濾杯的底部濾網浸入提取液中；將細胞保存液輕輕傾倒入沉降管中，保持細胞提取液與細胞保存液分層清晰，細胞保存液的加入需注意以下三方面：（1）保存液加入的量視細胞多少而定，若保存液非常清亮細胞少則可多加一點或者先將保存液離心，去上清吸取底部沉淀物加入到沉降管中，若保存液渾濁細胞多則可少加一點。加入的細胞量要適中，加入的細胞量過少容易產生涂片不均，出現空白區域不見細胞的現象，而細胞量過多易造成涂片厚薄不均，細胞重疊漂浮等現象，細胞過多過少均不便鏡檢。（2）若送檢標本含血液過多，可在細胞保存液中加入適量專用細胞清洗液，或者1 mL冰醋酸（保存液與冰醋酸之比為9:1）搖勻[1]，去除過多紅細胞以免影響鏡檢。（3）若標本含黏液過多，可先采用酶消化處理[2]；將沉降管中的過濾杯輕輕提起丟棄，不破壞細胞提取液與細胞保存液的分層；將制片器對稱放入MCT-2000液基薄層細胞制片機的吊籃中，相對位置底托擺放的方向一致，若不對稱擺放會導致離心制片機內制片器中的載玻片被毀壞的嚴重后果；開啟制片機800 r/min，2 min；取出制片器，傾去制片器中的上清液，向制片器沉降管內加入95%乙醇1～2 mL搖晃數次后傾去上清液，再加入95%乙醇1～2 mL固定30 s～2 min；取出載玻片進行巴氏染色。

1.2.3巴氏染色步驟 A、B兩組涂片同時染色，首先將兩組涂片于95%乙醇中固定10 min[3]；蘇木素中染色5 min，根據染液使用的時間長短或染片數量或環境溫度，適當增加或減少染色時間；自來水中漂洗，洗去多余蘇木素；0.5%鹽酸酒精中分化1～4 s，分化時間視分化液脫色力而定；流水反藍，自來水中流水沖洗不少于3 min；95%乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各1 min; EA50染色液中染色1～3 min, EA50染液更換時間以蘇木素染液的細胞核染色效果為準，需要更換時全套染液同時更換；梯度酒精脫水，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ缸各30 s，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各1 min。

1.2.4透明 A組涂片脫水干凈后放入環保透明劑中兩缸各透明5 min，取出涂片中性樹膠濕封片；B組涂片脫水干凈后直接從酒精中取出空氣中自然干片，中性樹膠干封片。

2.結果

A組酒精脫水后透明中性樹膠濕封片的涂片染色鮮艷，不同類型細胞顯色分明，核漿對比清晰，細胞核、核仁、核膜結構清晰，診斷信息明確（如圖1）。B組酒精脫水后直接空氣中自然干燥中性樹膠干封片的涂片出現胞膜分界欠清，胞質難以辨識，部分胞核濃染，染色質顆粒及核仁等細節無法觀察的現象（如圖2）。將A、B組涂片染色效果從色彩、細胞形狀及胞膜、核形狀及核細微結構三方面進行對比，見表1。

圖1 細胞輪廓感強，胞膜清晰銳利，胞質明顯

圖2 胞膜分界欠清，核漿對比模糊，染色質顆粒欠清晰

表1 液基細胞涂片染色后透明與否結果比較

3.討論

透明劑是一類能與乙醇、石蠟、中性樹膠互溶的有機溶劑，如二甲苯、甲苯、氯仿等有毒試劑及Histoclear、Van-clear、TO型生物制片透明劑（簡稱TO試劑）等環保透明劑，用于石蠟組織制片中，作為脫水、浸蠟過程的中介溶劑和封片時的透明劑及中性樹膠溶劑，以提高組織、細胞折光率。本實驗證明離心沉降式宮頸液基薄層細胞制片使用透明劑透明并濕封片，可顯著改善制片質量，未經透明可導致染色質量下降，出現背景污穢，透明度欠佳，部分胞核染色略加深，部分胞膜分界欠清，胞質欠明顯，核漿對比模糊，染色質顆粒欠清晰，核細微結構難以辨別等現象，嚴重影響診斷。

我科現有的透明劑有二甲苯，TO試劑，環保透明劑。其中二甲苯價格便宜、透明效果好、作用時間短被廣泛采用，但二甲苯是一種具有芳香氣味的揮發性液體，長期接觸可造成免疫功能低下，吸入二甲苯蒸汽可刺激眼、鼻、喉，高濃度時可致嚴重呼吸困難，甚至死亡，在生活中也多處滲透性侵入[4]，是公認的有毒的化學品之一。TO試劑是一種以優質松節油為主要原料并采用特殊配方合成的無色芳香透明液體，無毒，是一種安全、環保的新型試劑，能與乙醇互溶，能溶解石蠟、樹膠等，其效果與二甲苯無顯著差異。環保透明劑主要成分為液體石蠟，為無色無味的透明液體，不含苯，是一種環保的二甲苯替代物，環保透明劑具有低揮發性且對組織滲透較二甲苯柔和，即使透明時間長也不易造成組織的干澀、脆硬等現象，利于切片平整、完美，不會出現鏡下空洞與厚薄不均的現象[5]，也正是這種特性，使用環保透明劑透明細胞染色涂片時需適當延長時間。三種透明劑各有優劣，綜合考慮，我科選用環保透明劑作為常規透明劑使用，效果理想無毒無害環保，深受病理工作者的喜愛，見表2。

表2 二甲苯、TO試劑、環保透明劑優劣比較

目前正是新型冠狀病毒肺炎疫情期間，全球疫情仍在蔓延，且有可能較長時期存在，在液基細胞涂片制備過程中會直接接觸到患者的血液、體液感染性物質，暴露風險中等[6]。做好病理醫務工作者的防護工作，是預防和減少感染的關鍵舉措，更是維護其身體健康和生命安全的必然要求，操作人員在操作過程中應注意生物安全防護。根據《新冠肺炎疫情期間醫療機構不同區域工作崗位個人防護專家共識》中指出病理科工作人員處理一般患者標本防護標準為一級防護：（1）嚴格遵守標準預防的原則。（2）工作時穿工作服，戴工作帽和醫用外科口罩，戴乳膠手。（3）嚴格遵守消毒的各項規章制度，空氣消毒，首選自然通風，保證室內外空氣的流通，室內無人時使用紫外線燈照射消毒，每次消毒時間不少于1 h，每天2～4次；物體表面及地面的消毒，實驗前后1000 mg·L-1含氯消毒劑擦拭物體表面（操作臺、儀器、電腦）或拖地，每天至少2次，遇標本漏灑污染時，先去除污染再使用含有效氯2000 mg·L-1的含氯消毒劑消毒，作用30 min，注意消毒劑要現用現配，24 h內使用；生物安全柜消毒使用75%酒精，因含氯消毒劑有腐蝕作用一般不建議使用，消毒后清水清潔消毒，結束后開啟紫外殺菌燈消毒[7]。（4）嚴格執行手衛生，七步洗手法洗手，戴手套。

近年來宮頸癌發生率有上升趨勢，應引起高度重視，該病屬于可預防性疾病，但因其病理發展過程較長，早期臨床癥狀不具有典型性，早期診斷難度較高。因此，能夠通過早期篩查及時明確高危人群，從而及時給予合理規范的治療，以改善患者預后降低宮頸癌死亡率至關重要。

液基細胞學檢查方法具有操作方便、快速、無創、靈敏度高、準確性高等優勢[8]，作為國內普遍使用的宮頸癌前病變篩查工具。穩定的制片質量是保證其診斷準確的基礎，因此要求病理工作者掌握好離心沉降式宮頸液基薄層細胞制片染色技術，染色結束后透明濕封片制備出一張優秀的細胞涂片。優秀的液基薄層細胞涂片可提高診斷醫師閱片速率及臨床診斷準確性，起到早發現早診斷早治療的作用，降低宮頸癌的發病率。