QuEChERS-HPLC-MS/MS法同時測定豆芽中18種植物生長調節劑

王巖，王磊，鄭百芹，王帥，趙海濤，李彤

1.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2.河北省農產品質量安全檢測技術創新中心（唐山 063000）；3.唐山市功能性農產品產業技術研究院（唐山 063000）

植物生長調節劑（PGRs）是一類與植物激素具有相似生理和生物學效應的物質，也被稱為植物天然激素或植物內源激素，可影響和有效調控植物的生長和發育，包括從細胞生長、分裂，到生根、發芽、開花、結實、成熟和脫落等一系列植物生命全過程。近年來，濫用及不當使用PGRs的現象時有發生，影響農產品的食用安全，對人民健康造成威脅[1-4]。原國家食品藥品監督管理總局、原農業部及原國家衛生和計劃生育委員會發布的2015年11號公告中明令禁止在豆芽中使用6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸和赤霉素等生長調節劑類物質。因此，開展豆芽中植物生長調節劑殘留的快速檢測新技術研究，對保證食品安全、促進國民健康及社會經濟發展都有重要的現實意義。

中國關于植物生長調節劑的多殘留檢測技術和有關限量標準的基礎研究處于起步階段，多殘留同時檢測的國家標準尚未建立。有關植物生長調節劑殘留的檢測方法主要有酶聯免疫（ELISA）法[5]、氣相色譜（GC）法[6]、氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）法[7]、高效液相色譜（HPLC）法[8]、液相色譜-質譜（LC-MS）法和高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法[9]。GC和GC-MS/MS需要進行化學衍生，操作較為繁瑣。ELISA靈敏度較低，難以實現痕量分析。HPLC的靈敏度較低，基質干擾影響較大，前處理復雜并且容易造成假陽性干擾。HPLC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性好等優點，在滿足復雜基質痕量殘留分析的基礎上，實現多殘留化合物的同時分析，是PGRs殘留分析的優選方法。試驗采用QuEChERS方法結合HPLC-MS/MS測定豆芽中18種PGRs的殘留量，旨在為標準的修訂及有效監控豆芽中的PGRs殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460型HPLC-MS/MS（安捷倫科技（中國）有限公司）；099ADPM12型渦旋混勻儀（上海易擴儀器有限公司）；3-15型高速離心機（德國Hettich公司）；EVA50A型氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；T-200電子天平（常熟雙杰儀器制造廠）；SZ13022-NY 0.22 μm有機濾膜（天津市領航實驗設備股份有限公司）。

18種PGRs標準品：氯吡脲、赤霉酸、環丙酸酰胺、脫落酸、吲哚丙酸、吲哚乙酸、對氯苯氧乙酸、噻苯隆、6-芐氨基嘌呤、4-碘苯氧基乙酸、抑芽唑、2, 4-D、萘乙酸、烯效唑、抗倒胺、多效唑、吲哚丁酸、抗倒酯（純度≥99.0%，國家標準物質中心）；C18、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）（上海安譜公司）；甲醇、甲酸、乙腈、NH4AC（色譜純，美國ASC公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉、乙酸（分析純，上海國藥化學試劑有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱Phenomenex H18（50 mm×3.00 mm，2.60 μm）；進樣體積5 μL；柱溫35 ℃。流動相：A為含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇。梯度洗脫：0.5～5.0 min，10% B；5.0～8.0 min，95% B；8.0～12 min，10% B；流速0.25 mL/min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正（ESI+）、負（ESI-）離子掃描方式；霧化氣流量3.00 L/min；干燥氣流量15.00 L/min；DL管溫度250 ℃；電噴霧電壓（IS）2 500 V；掃描時間0.1 s；多反應監測模式（MRM）。

1.2.3 標準溶液配制

分別準確吸取100 μL質量濃度1 000 μg/mL的單個PGR標準物質，用甲醇定容至10 mL，得到質量濃度10 μg/mL的混合標準儲備液，于4 ℃冰箱內保存。取樣品空白溶液分別配制0.005，0.01，0.020，0.040和0.050 μg/mL的基質混合標準工作液，現用現配。

1.2.4 樣品前處理

稱取5.0 g豆芽樣品于離心管外管中，加入混合標準溶液（外標法），靜置30 min，加入10 mL 5%乙酸-乙腈（1∶99，V/V），加入萃取鹽包（內含5.5 g無水硫酸鎂、1.5 g氯化鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉和1.0 g檸檬酸鈉）及10顆鋯珠，擰緊內管（內含4 mm氧化鋯珠5粒、200 mg PSA、500 mg無水硫酸鎂和100 mg C18）后放入自動QuEChERS前處理儀器中開始處理，經25 min交替振蕩離心后，準確吸取1.0 mL上清液氮吹近干，用10%甲醇溶液定容，經0.22 μm的有機微孔濾膜，濾液供HPLC-MS/MS測定。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

分別取1 000 μg/L的18種PGRs標準溶液通過針泵注入質譜系統進行參數優化。在正、負離子模式下進行全掃描，掃描范圍m/z50～500，得到18種PGRs的一級質譜圖。由于18種PGRs的性質不同，其電離方式也有所差異，因此確定其合適的電離方式，以達到最高的電離效果。選擇響應最高的離子作為準分子離子，優化去簇電壓（DP），以獲得最強的母離子信號，并選擇響應較強的2個離子作為定量離子和定性離子，在多反應監測（MRM）模式下，優化碰撞能（CE）。質譜參數如表1所示。

表1 18種植物生長調節劑的質譜參數

2.2 色譜條件的優化

比較Phenomenex H18色譜柱（50 mm×3.00 mm，2.60 μm）、Zorbax SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 m，3.5 μm）和Waters Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm，7.0 μm）對待測物的分離效果，結果表明，18種PGRs在Phenomenex H18色譜柱上的分離效果和峰形最好。因此，試驗選擇Phenomenex H18色譜柱分析待測物。

試驗比較乙腈-水和甲醇-水作為流動相的分離效果，考察其對18種PGRs的洗脫效果，結果表明，使用甲醇-水作為流動相時，18種待測物在色譜柱上的保留時間最短，分離效果和峰形更好，因為甲醇作為有機相時，待測物具有更高的響應值和靈敏度。試驗表明，流動相中加入甲酸會使待測物的離子化，而乙酸銨對負離子模式下目標物的離子化效果具有促進作用。分別配制濃度為：1）0.1%甲酸-1 mmol/L乙酸銨-甲醇；2）0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨-甲醇；3）0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸銨-甲醇；4）0.3%甲酸-5 mmol/L乙酸銨-甲醇的流動相，試驗結果表明0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相時，各目標物的響應和峰形均為最優。在最優洗脫條件下，18種PGEs的保留時間在5.8～11.7 min。

2.3 凈化條件的優化

分散固相萃取技術（QuEChERS，即quick，easy，cheap，effective，rugged and safe），是近年來國際上最新發展起來的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術，其主要通過極性相互作用、非極性相互作用、離子相互作用等方式保留基質干擾成分，達到凈化效果。主要的吸附材料有石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）和C18，其中PSA主要對極性物質有較強的吸附作用，去除有機酸、色素、金屬離子和酚類等物質；GCB可有效去除色素；C18對非極性物質有很強的吸附作用。試驗選擇50 μg/L的混標質量濃度，考察（1）100 mg C18+25 mg GCB+500 mg MgSO4；（2）100 mg C18+200 mg PSA+500 mg MgSO4；（3）25 mg GCB+200 mg PSA+500 mg MgSO4；（4）100 mg C18+200 mg PSA+25 mg GCB+500 mg MgSO44種條件下的凈化效果和加標回收率，結果見圖1。其中，采用100 mg C18+200 mg PSA+500 mg MgSO4為凈化劑時，18種PGRs的回收率在80%～115%，因此，采用100 mg C18+200 mg PSA+500 mg MgSO4作為樣品凈化的吸附劑。

圖1 18種植物生長調節劑在不同凈化組合中的回收率（n=3）

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

基質效應是一個常見干擾因子，指樣品共提取的基質會影響目標物的離子化，產生的共提取物存在基質增強或抑制效應，采取適當的方法減少或消除，可以提高測定準確度和精密度。試驗以不含目標物的豆芽樣品作為空白基質，采用空白基質溶液配制標準溶液，以消除基質效應的影響。取質量濃度分別為0.005，0.010，0.020，0.040和0.050 μg/mL系列基質標準溶液，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程和相關系數見表2。結果表明，18種PGRs在質量濃度范圍0.005～0.05 μg/mL時具有良好線性關系，相關系數（r）均≥0.999 0。以3倍信噪比（S/N=3）計算方法檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）計算方法定量限（LOQ），結果顯示，18種PGRs的LOD為0.3～1.2 μg/kg，LOQ為1.0～5.0 μg/kg（表2）。

表2 18種PGRs的線性關系、相關系數、檢出限和定量限

2.4.2 方法的回收率和精密度

以不含目標組分的5.0 g豆芽樣品作為空白基質，添加18種PGRs標準品，分別配制添加質量濃度水平為10，100和200 μg/kg的樣品各3份，每個質量濃度水平重復測定6次，計算測定值的相對標準偏差（δRSD）。由表3可知，各添加質量濃度水平的平均回收率為85%～110%，δRSD為2.8%～7.5%，方法的準確度和精密度均滿足殘留分析的要求。

表3 18種PGRs添加回收率和精密度（n=6）

2.5 實際樣品分析

應用所建立的分析方法對市場上隨機購買的30批次豆芽樣品進行檢測，在受檢樣品中，其中有3個批次樣品檢出4-氯苯氧乙酸（4-CPA），其含量低于定量限；2個批次樣品檢出6-芐基腺嘌呤（6-BA），質量分數分別為2.4和10.6 μg/kg，為不合格樣品。其他16種PGRs均未檢出。

3 結論

試驗采用5%乙酸-乙腈（1∶99，V/V）作為提取溶劑，利用QuEChERS法對樣品進行凈化處理，通過優化色譜和質譜條件，建立豆芽中18種PGRs的HPLCMS/MS同時測定方法。該方法操作簡單、靈敏度高、重現性好，精確度和準確度均滿足方法學指標，可用于同時測定豆芽中18種PGRs殘留量。