楊梅果酒發酵工藝的優化及香氣成分分析

高甜甜 ，陽秀蓮，曾琦鵬，李高陽, ，劉偉, *，張菊華, *

1.湖南大學研究生院隆平分院（長沙 410125）；2.湖南省農業科學院農產品加工研究所（長沙 410125）；3.果蔬貯藏加工與質量安全湖南省重點實驗室（長沙 410125）；4.湖南瑞生源生物科技有限公司（冷水江 418400）

楊梅（MyricarubraSieb.& Zucc.）富含碳水化合物、有機酸、可溶性糖、礦物質、維生素和酚類物質等[1-2]營養成分，還具有多種生理功效，是良好的果蔬加工原料。目前，市面上有果汁飲料、楊梅罐頭、楊梅干和楊梅酒等產品，大大延長了楊梅的保質期，拓寬了其加工領域，豐富了果蔬制品市場。楊梅酒因其營養價值、藥用效果[3]以及獨特的風味，有極大的市場潛力。但是，目前關于楊梅酒的發酵工藝研究較少，工藝較為落后，導致產品的整體口感和品質不高，尤其是風味不足的問題，限制了楊梅果酒的發展。

此次試驗以酒精度為評價指標，通過單因素試驗、響應面法試驗，對影響楊梅酒發酵生產的主要工藝參數（酵母接種量、發酵溫度、加糖量、初始pH）進行了優化，并對最優工藝所得的楊梅成品酒的香氣成分進行了分析，以期為楊梅酒的發酵工藝的優化和產品品質的提升提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：RY1菌株（Saccharomyces cerevisiae）為課題組前期篩選所得。

楊梅汁：將成熟度良好的新鮮楊梅原料洗凈壓榨，過濾后將楊梅汁用干凈的塑料罐進行分裝，在-40 ℃的冰箱內保存。

焦亞硫酸鉀（食品級），淄博長城化工有限公司；其他試劑為實驗室常用AR級試劑。

1.2 主要儀器與設備

HWS型智能恒溫恒濕培養箱，寧波江南儀器廠制造；6890-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；SHA-B型恒溫水浴振蕩器，金壇市醫療儀器廠；50/30 μm固相萃取儀，德國CNW公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅果酒釀造工藝流程

楊梅→清洗→榨汁→調整成分→添加偏重亞硫酸鈉，室溫放置6～8 h→接種→發酵→二次加糖→發酵→倒罐過濾→后發酵→陳釀→下膠→過濾→灌裝殺菌→成品

1.3.2 單因素試驗

以酒精度為主要指標，在其他工藝條件保持一致的條件下，分別調整酵母菌接種量、發酵溫度、加糖量和pH進行單因素試驗。試驗梯度設計：接種量1%，3%，5%，7%和9%；發酵溫度18，21，24，27和30 ℃；加糖量150，170，190，210和230 g/L；pH 2.5，3.0，3.5，4.0和4.5。

1.3.3 響應面試驗

根據單因素試驗的結果，以加糖量、接種量、pH、發酵溫度為響應因素，酒精度為響應值，進一步進行響應面試驗設計。因素水平編碼見表1。

表1 響應面因素與水平編碼

1.3.4 香氣成分的測定

1.3.4.1 樣品制備

參照文獻[4]的方法，略作修改。將10 mL楊梅酒樣品放入20 mL頂空瓶，再加1.5 g NaCl進行測定。

1.3.4.2 GC-MS條件

GC條件，參照文獻[5]的方法，略作修改。氣相色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣是高純氦氣，流速是1.67 mL/min。采用無分流模式進樣，進樣量為1 μL。進樣口溫度250 ℃；柱溫箱升溫程序：40 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min的速率升溫到160 ℃，保持2 min，然后再以8 ℃/min的速率升溫到220 ℃保持10 min。

MS條件：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式EI，離子能量70 eV；質量掃描范圍33～550 U。

1.4 數據處理

主要使用Excel 2016、Origin 2018處理數據，用Design-Expert 8.0.6設計并分析發酵楊梅酒的最佳工藝條件。所有數據用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 最佳接種量的確定

控制加糖量190 g/L、發酵溫度24 ℃、楊梅汁pH 3.0，分析接種量對楊梅果酒酒精度的影響。由圖1可知，酒精度的大小受酵母接種量的影響。接種量太少，發酵周期被延長，酒精度低。隨著發酵菌株接種量增加，酒精度先上升后下降。在接種量7%的條件下，酒精度達到最高值9.0%vol。當接種量過高時，發酵液中的營養難以滿足酵母自生快速增殖擴代，且大部分用于酵母的增殖使得酒精度低，同時還會引起果酒澄清度降低，酵母味過。因此，選擇接種量5%，7%和9%作為后續試驗參數。

圖1 接種量對楊梅酒酒精度的影響

2.1.2 最佳發酵溫度的確定

控制加糖量190 g/L、楊梅汁pH 3.0、接種量5%，分析發酵溫度對楊梅果酒酒精度的影響。由圖2可知，發酵溫度對酒精度有影響，隨著發酵溫度的增加，酒精度呈現先增加后減小的趨勢，在24 ℃條件下，酒精度最高。這是由于溫度可以顯著地影響發酵菌種活性，從而影響其發酵性能[6]。溫度較低時，菌株活性較低，發酵速率較慢，發酵周期被延長。隨著溫度的升高，酒精度增大，但是溫度過高時，酒精度減小。這可能是由于菌株在高溫環境下，對于酒精的毒害作用更加敏感[7]，發酵能力降低。因此，選擇發酵溫度21，24和27 ℃作為后續試驗參數。

圖2 溫度對楊梅酒酒精度的影響

2.1.3 最佳加糖量的確定

控制發酵溫度24 ℃、楊梅汁pH 3.0、接種量5%，分析加糖量對楊梅果酒酒精度的影響。由圖3可知，加糖量較低時，酵母發酵糖源較少，酒精度較低，隨著加糖量增加，酒精度也有所上升，當加糖量為230 g/L時，酒精度最大。但是在230 g/L的條件下，發酵速度放慢，且發酵產物的可溶性固形物含量比其他4個水平高，這表明發酵菌株在該條件下沒有將發酵液中的糖利用完全。而前4個水平條件下的發酵產物的可溶性固形物含量相等，且在加糖量210 g/L時，酒精度最高，這表明其為最優水平。因此，選擇加糖量190，210和230 g/L作為后續試驗參數。

圖3 加糖量對楊梅酒酒精度的影響

2.1.4 最佳pH的確定

控制發酵溫度24 ℃、接種量5%、加糖量190 g/L，分析楊梅汁pH對楊梅果酒酒精度的影響。由圖4可知，pH 2.5時，酒精度較小，在pH 3.0的條件下，酒精度顯著增大，之后隨著pH的增加，發酵產物酒精度變化較小，考慮到pH會對楊梅果酒的顏色產生顯著影響，且在酸性條件下，果酒的色澤最好，因此選擇pH 2.5，3.0和3.5作為后續試驗參數。

圖4 pH對楊梅酒酒精度的影響

2.2 RY1菌株發酵楊梅果酒響應面分析

2.2.1 響應面設計及結果

結合單因素試驗結果，利用Design-Expert 8.0.6軟件，進行響應面試驗，結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.2 模型、方差及交互作用分析

通過軟件分析，擬合A（pH）、B（加糖量）、C（接種量）、D（溫度）后，得到關于酒精度（R）的二次多項回歸方程模型：R=8.76+0.20A+0.81B-0.25C-0.008 333D+0.28AB+0.18AC+0.05AD+0.10BC+0.20BD+0.32CD+0.31A2-0.23B2-0.24C2+0.52D2。

由表3可知，二次方程模型極顯著（p＜0.000 1）；失擬項p值0.241 8＞0.05，說明該模型與試驗數據的擬合程度較好，試驗誤差小，可以用于預測不同變量條件下的響應值。對模型系數的顯著性分析表明，因素B對果酒酒精度的影響極顯著（p＜0.01），因素C對果酒酒精度影響顯著（p＜0.05），各項單因素對果酒酒精度的影響的顯著性由大到小依次是加糖量（B）＞接種量（C）＞pH（A）＞發酵溫度（D）。

表3 回歸模型方差分析及參數估計

由圖5可知，在4個因素中，兩兩之間的交互作用較弱，且各交互項對響應值的影響均不顯著。運用軟件Design-Expert 8.0.6，結合二次回歸模型的數學分析，可以得到楊梅果酒發酵工藝的最佳工藝參數：接種量8.47%、發酵溫度27 ℃、pH 3.5、加糖量為229.95 g/L。在此發酵條件下，酒精度均值為11.1%vol。

圖5 響應曲面圖

2.3 發酵前后楊梅果酒香氣成分分析

發酵前后楊梅汁樣品中香氣成分見圖6。通過對各組分的鑒定分析，發酵前后的樣品中共檢出46種主要香氣成分，主要是17種酯類、12種醇類、3種酸類、5種烯烴類、2種烷烴類及7種其他化合物，其中乙酸乙酯、3-己烯醇、庚醇、1-辛醇、3-壬烯-7-醇、芳樟醇、石竹烯等10種化合物在發酵前后樣品中均有檢出，發酵過程新增加了16種化合物，以酯類和醇類為主。

圖6 發酵前后楊梅汁樣品揮發性風味物質總離子流圖

在發酵前的楊梅汁中，共檢測到30種香氣成分，占總峰面積的96.73%。其中，烯烴類（33.83%）、酯類（17.09%）含量較高。烯烴類物質大多具有水果香、花香，且閾值較低，對楊梅汁的風味起著重要作用。特征成分β-石竹烯占總揮發性香氣成分的29.69%，是楊梅汁的主要風味物質，賦予楊梅汁辛香、木香及丁香香氣。張楊等[8]、Cheng等[9]、徐磊等[10]、程喚[11]的研究結果均顯示石竹烯是楊梅汁最主要的揮發性風味物質，這與此次試驗結果一致。

楊梅酒中共有27種香氣成分，占總峰面積的96.75%。主要的香氣成分是酯類（32.88%）和醇類化合物（61.57%），烯萜類相對含量下降了32.36%，其特征成分石竹烯在發酵后基本損失殆盡，這與侍崇娟等[12]的研究結果一致。

酯類物質多數具有明顯的花香味，對楊梅果酒香氣的形成占主要貢獻。經發酵的楊梅酒樣品，其酯類物質明顯增多，其中辛酸乙酯（11.12%）、癸酸乙酯（11.91%）、乙酸乙酯（4.85%）和月桂酸乙酯（2.7%）是楊梅酒果香的主要呈味物質，新檢測出癸酸乙酯、3-壬烯酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸乙酯等。辛酸乙酯具有果香、白蘭地酒香味、脂肪味；癸酸乙酯具有果香和白蘭地酒香[13]；乙酸乙酯有明顯的的酯香和水果香氣。

醇類物質是楊梅果酒香氣的主要成分之一。經發酵的楊梅酒樣品，醇類物質相對含量明顯提高，主要是乙醇（41.92%）、1-辛醇（4.35%）、芳樟醇（4.39%）、3-己烯醇（2.41%）、異戊醇（2.26%）、庚醇（2.13%）。乙醇賦予楊梅酒甜香的風味特征；芳樟醇具有清新而強烈的鈴蘭花香氣，其閾值較低，香氣值較高，影響果酒的整體香氣。楊梅汁經發酵，其醇類、酯類風味化合物相對含量增加，烯萜類風味化合物降低，這表明對于楊梅酒的風味來說，三者之間的平衡較為重要。

表4 主發酵前后楊梅果酒香氣成分的變化

3 結論

此次試驗采用單因素試驗和響應面試驗，以酒精度作為指標，優化楊梅酒的發酵工藝參數，得到RY1發酵楊梅酒最佳工藝條件：接種量8.47%、pH 3.5、發酵溫度27 ℃、加糖量229.95 g/L。在此條件下，楊梅酒酒精度為11.1%vol。采用SPME-GC-MS分析發酵前后楊梅汁的揮發性風味物質，楊梅汁中共檢測出30種香氣成分，以烯烴類（33.83%）和酯類（17.09%）化合物為主，特征成分β-石竹烯占總香氣成分的29.69%，是楊梅汁的主要風味物質。發酵后楊梅酒中共檢測出27種香氣成分，醇類（61.57%）和酯類（32.88%）化合物相對含量提高，發酵后新增加了辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯等16種化合物，烯萜類相對含量下降了32.36%。正是這些揮發性風味物質的變化，相互協調與平衡，賦予了楊梅酒香味濃郁怡人的風味品質。