亞急性瘤胃酸中毒對泌乳奶牛血漿生化指標及代謝組的影響研究

亓王盼，牟英玉，張濤，張繼友，毛勝勇*

（1.國家動物消化道營養國際聯合研究中心，江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室，南京農業大學消化道微生物研究室，江蘇南京210095；2.動物科學類國家級實驗教學示范中心，南京農業大學，江蘇 南京210095）

亞急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）是由于反芻動物長期采食過量的易發酵碳水化合物，導致瘤胃內揮發性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）大量累積，使瘤胃p H值較長時間內維持在5.2～5.8之間的一種營養代謝疾病［1-2］。SARA嚴重影響奶牛瘤胃健康、泌乳性能及機體健康，其已成為危害現代奶牛健康生產的主要問題之一［3］。反芻動物患SARA后，瘤胃的消化代謝受到影響，尤其是VFA濃度及組成發生改變，由于VFA是反芻動物能量物質的主要來源，因此，VFA的組成及數量的變化可能影響到進入機體的營養物質數量［4-5］，進而影響到機體營養代謝。一些研究也發現，SARA可影響奶牛機體氨基酸和碳水化合物代謝［6-7］。然而，以往的這些研究主要集中在對某種或某類代謝物的研究，很少有研究探討SARA對奶牛整體代謝的影響。

近年來，代謝組學的發展為研究機體代謝提供了新思路，代謝組學可以檢測出關鍵代謝通路上的多種代謝物，有助于加深對代謝紊亂背后機制的了解。代謝組學技術目前已用于監測奶牛瘤胃代謝組的變化［8-10］。血液是機體重要的媒介體液，其中包含了很多由機體代謝產生并聯系不同器官組織的代謝產物［11］。Zhang等［12］通過對奶牛血液代謝組學的檢測來篩選與奶牛酮病有關的生物標志物；最近，Sun等［13］通過對血液及其他體液的代謝組的共同檢測，篩選出與奶產量和奶品質相關的代謝物并作為生物標記物。迄今，關于SARA對奶牛血液代謝產物的影響的研究仍主要集中在對血液中葡萄糖、游離脂肪酸、β-羥丁酸、膽固醇等常規參數的測定［7，14］，而對其血液整體代謝產物的研究相對較少，因此，本試驗通過對奶牛血漿生化指標及血漿代謝組的測定，研究了SARA對奶牛血漿代謝產物的影響，擬為尋找與SARA相關的代謝標記物以及為SARA的診斷和治療提供新依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗于2019年2月在江蘇省泰州市姜堰牧場進行。選取8頭裝有永久性瘤胃瘺管、健康和體況相似的2～3胎泌乳中期奶牛，隨機分為兩組，每組4頭奶牛。試驗采用全混合日糧。一組飼喂精粗比為4∶6的對照組日糧（control group，CON），一組飼喂精粗比為6∶4的處理組日糧（subacute ruminal acidosis group，SARA），試驗周期為21 d。全混合日糧配方及營養水平見表1，每天8：00和19：00各飼喂1次。在試驗期間采用單欄拴系飼養，剩余采食量控制在采食量的10%左右。奶牛自由采食與飲水。

表1 日糧配方及營養水平Table 1 Ingredient and nutrient composition of diet

1.2 樣品采集

于試驗期每周的最后2 d檢測采食量，于試驗期每周最后1 d晨飼后0、2、4、6、8及12 h從瘤胃腹囊部采集瘤胃內容物，將所取得的瘤胃內容物經4層紗布過濾。所得瘤胃液立即用便攜式p H計（HI 99161；HANNA Instruments，美國）測定其pH值。于試驗期每周最后1 d晨飼后6 h，用肝素鈉真空采血管從頸靜脈采集10 mL血液，室溫下2500 r·min-1離心10 min分離出血漿，一部分存放于液氮中，用于后續代謝組學檢測，一部分存放于-20℃，用于后續生化指標的測定。

1.3 血漿生化指標測定

使用β-羥丁酸（β-hydroxybutyric acid，BHBA）、葡萄糖（glucose，Glu）、總膽固醇（cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）和游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）測定試劑盒（建成生物，南京）對試驗期每周最后1 d采集的共24個血漿樣品中的β-羥丁酸、葡萄糖、膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸含量進行測定。具體方法參照試劑盒說明書。

1.4 代謝組學分析

樣品預處理：將24個血漿樣本置于室溫解凍，用移液槍吸取100μL樣本于1.5 mL EP管中；加入300μL甲醇，并加入10μL內標（2.8 mg·mL-1，2-氯苯丙氨酸）；渦旋混勻30 s，-20℃靜置1 h；置于4℃離心機中，12000 r·min-1離心15 min；吸取200 μL上清液，轉入進樣小瓶中待檢測。采用LCMS（Thermo，Ultimate 3000LC，Q Exactive）儀器分 析 平 臺，C18色譜柱［Hyper gold C18（100.0 mm×2.1 mm，1.9μm）］；色譜分離條件為柱溫40℃；流速0.3 mL·min-1；流動相組成A：水+5%乙腈+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；進樣量為10μL，自動進樣器溫度4℃；流動相梯度洗脫程序參考表2；之后按照正模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.0 KV；毛細管溫度：350℃；S-Lens RF Level，30%；負模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.2 KV；毛細管溫度：350℃；S-Lens RF Level，60%的質譜檢測參數進行檢測。

表2 流動相洗脫程序Table 2 Mobile phase elution procedures

1.5 數據分析

采用SPSS 22.0中的混合模型（mix model）對瘤胃p H進行統計，其中日糧和飼喂天數作為固定效應因子，牛作為隨機效應因子，每天的采樣時間點作為重復測量因子。采用SPSS 22.0中的一般線性模型（general linear model，GLM）對血漿生化指標進行統計。P＜0.05表示差異顯著，0.05＜P＜0.1表示具有差異顯著的趨勢。使用Compound Discoverer軟件（Thermo公司）對LC/MS檢測數據進行提取和預處理，并在Excel 2010中對數據進行歸一化及后期編輯，最后整理成二維數據矩陣形式，包含保留時間（retention time；RT）、分子量（molecular weight，Comp MW）、觀察量（樣本名稱）、可提取物質個數（ID）和峰強度等信息。運用SIMCA-P軟件（Version 13，Umetrics AB，Sweden）對最終得到的數據進行多維統計分析。通過主成分分析（principal component analysis；PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis；PLS-DA）獲得實驗參數和樣本信息之間的相互關系，同時獲得描述變量對模型的貢獻度的數值（variable importance in the projection，VIP）。用非參數檢驗計算兩組P值，然后用′p.adjust′［R（v3.6.1）］對P值進行false discovery rate（FDR）校正。以VIP＞1，FDR＜0.05為條件來篩選差異代謝物。通過MetaboAnalys（thttp：//www.metaboanalyst.ca）進行差異代謝物的通路分析，并計算兩組差異代謝物之間的倍數變化關系（fold change，FC）。

2 結果與分析

2.1 瘤胃pH變化

與CON組相比，SARA組的pH顯著降低（6.13 vs 5.65，P=0.002），在1 d內小于5.8的時間大于3 h，因此本試驗成功誘導SARA模型。兩組之間的干物質采食量沒有顯著差異（23.79 vs 22.40，P=0.524）（圖1）。

圖1 晨飼后12 h內瘤胃p H隨時間的變化Fig.1 Changes in the ruminal p H within 12 h after morning feeding（means±SEM，n=4）

2.2 血漿生化指標

與CON組相比，SARA組的β-羥丁酸濃度顯著下降，甘油三酯的濃度顯著上升，葡萄糖的濃度有顯著增加的趨勢（表3）。

表3 亞急性瘤胃酸中毒對血漿生化指標的影響Table 3 Effects of SARA on plasma biochemical indexes

2.3 血漿代謝組學分析

根據Excel數據表中的Mass值，基于網絡數據庫Metlin進行全譜鑒定。本試驗共鑒定出207種代謝物，這些代謝物主要包括氨基酸類、核苷類、糖類、有機酸類、脂肪酸類、脂質類等。

2.3.1主成分分析和最小二乘法分析CON和SARA組比較的PCA得分結果表明，CON和SARA組能明顯分開（圖2A，B），說明兩組樣本之間的血漿代謝物存在明顯差異。PLS-DA模型中兩組形成兩個明顯的組別，分布在第一主成分兩側（圖2C，D），正負模式條件下的R2Y和Q2分別為0.984，0.770和0.974，0.769，R2Y代表在Y軸方向模型的累積解釋率，Q2代表模型的累積預測率；置換檢驗分析可以看出，回歸線在Y軸上的截距均小于0（圖2E，F），說明該模型對兩組的區分有較好的預測和解釋。

圖2 CON和SARA組正負模式下的主成分分析得分（A，B），偏最小二乘法分析得分（C，D）和置換檢驗（E，F）Fig.2 PCA model score scatter（A，B），PLS-DA model（C，D）and permutation test（E，F）

2.3.2 血漿差異代謝物篩選 以VIP＞1，FDR＜0.05為篩選標準，最終篩選出26種差異代謝物，主要為脂質及脂肪酸、氨基酸、有機酸和苯甲酸類物質（表4）。與CON組相比，SARA組7-酮脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、12-酮脫氧膽酸、12（13）Ep-9-KODE和12，13-DHOME顯著上調，十一烷二酸、十六烷二酸、9-HODE、血氧烷B3和前列腺素E2顯著下調；除L-天冬酰胺外，所有的氨基酸類物質均顯著下調；所有的有機酸和苯甲酸類物質均顯著下調。進一步使用MetaboAnalyst4.0網站對差異代謝物進行代謝通路分析，發現與SARA相關的差異代謝物主要富集在氨酰t-RNA生物合成和纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成這兩條代謝通路上（圖3）。對差異代謝物進行聚類分析，直觀的顯示出了這些差異代謝物在兩個組的每個樣品中的具體情況。可以看出（圖4），CON組的4頭牛顯著聚為一類，SARA組的4頭牛顯著聚為一類，同時膽酸類物質顯著聚為一類，SARA組均顯著上調。

圖3 兩組差異代謝通路圖Fig.3 Metabolome pathway of the significantly different metabolites identified in the two groups

圖4 CON組和SARA組的血漿差異代謝物分層聚類分析熱圖Fig.4 Heatmap of hierarchical clustering analysis of differential plasma metabolites in CON and SARA group

表4 血漿差異代謝物Table 4 Plasma differential metabolites

3 討論

代謝組學是對特定條件下的特定生物樣品中的所有代謝物所進行的定性定量分析，目前該技術已廣泛應用于疾病發生、藥物殘留和食品檢測等領域。本試驗采用LC-MS平臺，檢測了患SARA后，奶牛血漿代謝物的變化情況，擬進一步探究SARA與奶牛機體新陳代謝之間的深層聯系，并尋找與SARA相關的生物標志物。

3.1 脂代謝

本研究發現，相比于CON組，SARA組奶牛血漿中的BHBA含量顯著下降，而甘油三酯的含量顯著上升，同時引起了一些脂肪酸濃度發生變化。有研究指出，血中的BHBA、游離脂肪酸和甘油三酯是反芻動物乳腺合成乳脂的重要前體物［15-16］，這些物質濃度的變化可能會對乳脂合成造成影響。同時，BHBA是酮體的主要成分之一，是肝臟中由脂肪代謝過程合成的小分子。先前有研究表明，當奶牛飼喂含大麥谷物的日糧時，血漿中BHBA的濃度會隨著大麥比例的增加而降低［14］；Guo等［7］和孫燕勇等［17］也發現患SARA的奶牛血漿中BHBA濃度降低，李小杉等［18］和孫玲偉等［19］在臨床上證實，發生亞臨床酮病時，奶牛血液中BHBA含量為1.2 mmol·L-1。本試驗中，血漿BHBA含量都在正常范圍內，可以初步判斷SARA發生時試驗動物無酮病隱患。甘油三酯主要是在肝臟、脂肪組織和小腸中合成，其中以肝臟的合成能力最強。有研究指出，血漿中甘油三酯濃度的增加與脂肪肝有關，引發機體炎癥反應［20］。綜上，這些物質濃度的變化可能表明SARA引起奶牛肝臟功能受損，使機體脂代謝發生紊亂。

膽汁酸主要是由肝臟中的膽固醇合成，膽酸是一種初級膽汁酸，主要在肝臟中合成，脫氧膽酸是一種次級膽汁酸，主要由膽酸在腸道中合成［22］。本研究發現，SARA組奶牛血漿中的多種膽汁酸類物質（7-酮脫氧膽酸，脫氧膽酸，膽酸和12-酮脫氧膽酸）聚為一類并且含量均顯著上升。有研究表明，高濃度的膽汁酸對機體有毒性作用，膽汁酸濃度過高時會對培養的牛胰管上皮細胞造成組織損傷［21］。另外，膽汁酸在脂質代謝中起重要的調節作用，膽汁酸的合成速率與高脂血癥患者血漿甘油三酯水平的升高有關［23］。因此，SARA組膽汁酸含量的增加可能與甘油三酯含量的增加有關。肝腸循環是調節膽汁酸代謝的重要途徑，膽汁酸在肝臟合成后經膽鹽輸出泵進入膽囊，進食后分泌入腸道，最后在回腸中被重吸收，然后通過門靜脈血液回到肝臟，重新分泌到膽汁中［22］，該過程是一個動態平衡過程。由此，本研究中，發生SARA的奶牛血漿中膽汁酸含量的升高，可能預示著其膽汁酸的肝腸循環受阻，大量膽汁酸淤積在血漿中無法回到肝臟。本試驗同時發現，SARA組奶牛血漿中的前列腺素E2和類前列腺素的濃度下調。前列腺素（prostaglandin，PG）是生物體內的一種局部激素，它具有多種生理活性作用，能與特異性受體結合后介導細胞增殖、分化、凋亡等一系列細胞活動以及調節雌性生殖功能和分娩、血小板聚集、心血管系統平衡［24］。其主要是由不飽和脂肪酸組成的，因此，前列腺素在SARA組濃度的下調可能也與脂肪酸代謝有關。

3.2 氨基酸代謝

本實驗發現，與CON組相比，SARA組的L-天冬酰胺顯著上升，其余發生變化的氨基酸（精氨酸、色氨酸和蘇氨酸）均顯著下降。在上述氨基酸中，精氨酸主要參與TCA循環和尿素循環［25］；色氨酸和蘇氨酸均為生糖氨基酸，生糖氨基酸水平的降低，表明它們可能作為底物進入三羧酸循環提供能量或參與糖異生過程產生葡萄糖［26］。差異代謝物中雖沒有檢測到甘氨酸的變化，但在SARA組奶牛血漿中發現多種酰基甘氨酸（異丁酰甘氨酸、異戊酰甘氨酸、馬尿酸和4-羥基馬尿酸）的濃度降低。在這些發生顯著變化的酰基甘氨酸中，馬尿酸是苯甲酰甘氨酸，是苯甲酸與甘氨酸的綴合物，其主要在肝臟中合成，通過此反應，機體可清除苯甲酸的毒性。因此，SARA組馬尿酸濃度的降低，可能會造成苯甲酸等代謝廢物在體內的積累，增加機體的患病風險［13，27］。

3.3 糖代謝

在本試驗中發現SARA組血漿中葡萄糖濃度有顯著升高的趨勢，這可能與SARA條件下奶牛瘤胃內丙酸濃度增加有關［28］，由于進入肝臟的丙酸數量增加，因而經糖異生作用生成的葡萄糖的量也有所上升，該結果也與前人的研究結果一致［7，14，29］。6-磷酸-2-脫氫-D-葡萄糖酸酯是磷酸戊糖途徑的中間產物，其在SARA組奶牛血漿中的含量減少，在一定程度上暗示了糖代謝的磷酸戊糖途徑受阻，葡萄糖氧化分解減少。最后，針對以上討論，將差異代謝物可能參與的代謝途徑進行總結（圖5）。

圖5 奶牛血漿差異代謝物可能參與的代謝途徑Fig.5 Proposed metabolic map of main plasma differential metabolites

4 結論

綜上所述，本試驗采用LC/MS代謝組學技術，研究了飼喂高谷物日糧后奶牛血漿代謝物的變化情況。結果表明，與CON組奶牛相比，SARA組奶牛血漿中甘油三酯、膽汁酸類物質、12（13）Ep-9-KODE、12，13-DHOME和L-天冬酰胺等物質含量升高，而BHBA、十一烷二酸、十六烷二酸、PGE2、L-精氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、6-磷酸-2-脫氫-D-葡萄糖酸酯和馬尿酸等物質含量降低，表明SARA組奶牛脂代謝、氨基酸代謝和糖代謝都受到了不同程度的影響，這些物質也可作為判斷SARA的潛在生物標志物。