妊娠早期飼糧中添加N-氨甲酰谷氨酸對母羊早期胚胎存活及相關血液指標的影響

蔡元，羅玉柱，臧榮鑫，李春陽，扎西英派

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030；2.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州730070）

胚胎產前損失是哺乳動物繁殖過程中遇到的一個主要問題，綿羊（Ovisaries）和大多數哺乳動物的胚胎死亡損失在20%～40%，其中2/3發生在妊娠的附植期［1］，這嚴重限制了哺乳動物繁殖性能的發揮。胚胎著床失敗是造成這些早期妊娠損失的主要原因，因此，減少早期胚胎著床失敗是提高哺乳動物生殖效率的重要方法。雖然已有大量研究表明營養在胎兒發育和后續妊娠中發揮重要作用，但有關特定營養素對胚胎著床、胚胎存活和胚胎發育的影響的研究有限［2］。研究表明，精氨酸是體內合成一氧化氮（nitric oxide，NO）、多胺、蛋白質等物質的前體，精氨酸的代謝物NO對胚胎著床、胚胎發育和滋養層侵入、胎盤血管生成具有積極的調控作用［3-7］。但是精氨酸成本高，且飼糧中添加的精氨酸能夠被反芻動物瘤胃微生物降解，因此，在生產中難以推廣使用。N-氨甲酰谷氨酸（N-carbamylglutamate，NCG）是內源性精氨酸合成的激活劑［2］，能夠促進精氨酸內源合成［8］。妊娠飼糧中添加NCG能促進大鼠早期胚胎著床和改善產仔性能［7］，在妊娠早期的母豬飼糧中添加NCG能夠降低胚胎死亡率［9］、顯著增加每窩產活仔數［2］，妊娠飼糧中添加NCG對改善胎盤血管功能、促進胎兒營養供應具有重要作用［10］，飼糧中添加NCG可促進雞卵巢血管生成，促進卵泡發育［11］，限飼母羊日糧中補充NCG能夠促進母羊胎盤的生長發育［12-13］，還可促進營養不良母羊的胎兒生長［14-15］。但目前還未見母羊妊娠早期飼喂NCG效果的相關報道。為此，本研究擬在母羊妊娠早期飼糧中添加NCG，研究其對胚胎存活、胎兒數量等指標的影響，以及對血漿游離氨基酸、總一氧化氮合酶（total nitric oxide synthase，TNOS）、內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthetase，eNOS）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、NO、雌二醇、孕酮的影響，初步探討NCG對妊娠早期母羊繁殖性能的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

NCG（C6H10N2O5）≥97.0%，水分≤1.0%，總砷（以As計）≤0.5 mg·kg-1，鉛（Pb）≤0.5 mg·kg-1，生產批號為T 190228031，為白色粉末，有微酸味，由國家飼料工程技術研究中心提供。

1.2 實驗動物與試驗設計

本試驗所用母羊為純種初產湖羊，35 kg時開始挑選生長狀況良好，有過發情記錄的母羊，最終選擇50只發情正常、健康狀況良好的母羊進行試驗。將50只母羊隨機分為2組：對照組和試驗組，每組25只羊，每只母羊為1個重復，基礎飼糧參照NRC（2004）體重40 kg的母綿羊妊娠前期的營養需要量配制。對照組飼喂基礎飼糧（表1），試驗組飼喂添加0.11%NCG的基礎飼糧。母羊采用同期發情人工授精方式配種，配種當天計為妊娠第0天，從第一次人工授精開始給母羊分別飼喂各組試驗飼糧，飼喂期38 d。

表1 飼糧組成和營養水平（干物質基礎）Table 1 Composition and nutrient levels of diets（dry matter basis）

1.3 飼養管理及樣品采集

試驗于2019年8-10月在蘭州七里河萬山種植養殖專業合作社進行。母羊妊娠期平均飼喂量為2.7 kg（常規含水量），每天08：30和16：00飼喂兩次。按照規章制度對羊場定期進行消毒和清潔，保持良好的通風。在14 d時開始用公羊試情，35 d時用B超測孕。每組選擇8只體況相近的懷孕母羊，在妊娠第19、38天上午空腹頸靜脈采血10 mL，置于有肝素鈉的離心管內，靜置30 min后，在4℃下以3000 r·min-1離心10 min后分離血漿樣品，將血漿分裝于1 mL的離心管中，保存于-80℃的超低溫冰箱，用于測定血漿氨基酸、eNOS、iNOS、TNOS、NO；38 d采血后，各選取7只懷孕母羊將其屠宰，然后立即剖腹獲取子宮稱重后將其置于冰上，統計黃體數量，剪開子宮體，收集胎水、胎羊，記錄胎水體積，記錄胎羊數量和重量，測定胎羊的體長和體高，統計胎盤數、胎盤的長徑和短徑。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 母羊繁殖性能 記錄黃體數量、子宮重、總胎兒數、活胎兒數、活胎兒總重、胎水體積，統計直徑大于0.5 cm的胎盤的數量，測定最大的5個胎盤的長徑和短徑，測定胎兒的體長、體高和胎兒形成指數，本試驗中的胎兒形成指數為38 d的胎兒數除以黃體數的大小，取值范圍在0～1，在母羊健康狀況、精液質量、輸精條件一定的情況下，其主要影響因素為子宮內環境，其值越大，表示發情母羊排出的卵子受精、形成胚胎、發育成胎兒的能力越強，胚胎和胎兒的存活率越高。

1.4.2 血漿氨基酸濃度 采用德國賽卡姆Sykam（S-433D）（德國賽卡姆公司）氨基酸自動分析儀測定。

1.4.3 血漿TNOS、iNOS、eNOS、NO、雌二醇和孕酮濃度的測定 用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按相應的試劑盒說明測定血漿TNOS（A 014-2-2）、iNOS（A 014-1-2）、eNOS（H 195，48 T）、NO（A 012-2-1）、雌二醇（H 102，48T）和孕酮（H 089，48T）的濃度。

1.5 數據處理

采用SPSS 23.0統計軟件進行t檢驗，數據結果以平均值±標準誤表示，統計顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊繁殖性能的影響

對照組和NCG組屠宰的7只母羊均懷孕。與對照組相比（表2），在妊娠第38天時，NCG組每只母羊總胎兒數增加了79.72%（P＜0.05），活胎兒數增加了79.72%（P＜0.05），胎水體積增加了72.89%，胎兒形成指數增加了0.26（P＜0.05）。然而黃體數、子宮重有增加但差異不顯著（P＞0.05），直徑大于0.5 cm的胎盤數減少了2.96個（P＞0.05），直徑最大的5個胎盤的平均面積減少0.07 cm（2P＞0.05），NCG組的受胎率提高了5.20%（P＞0.05），飼糧添加NCG對母羊增重也沒有顯著影響（P＞0.05）。說明母羊妊娠早期飼糧中添加NCG后能夠顯著提高妊娠第38天的總胎兒數和活胎兒數，顯著增加胎水體積，顯著提高胎兒形成指數，能夠改善湖羊的繁殖性能。圖1為對照組妊娠第38天32號綿羊子宮的照片，圖2為NCG組妊娠第38天19號綿羊子宮的照片，由圖可見19號綿羊有3個黃體。圖3為對照組妊娠第38天32號綿羊卵巢和胎兒的照片，32號綿羊有2個黃體和1個胎兒。圖4為NCG組妊娠第38天19號綿羊胎兒的照片，19號綿羊有3個胎兒。

圖1 對照組綿羊子宮Fig.1 Control group sheep’s uterine

圖2 NCG組綿羊子宮Fig.2 NCG group sheep’s uterine

圖3 對照組母羊卵巢和胎兒Fig.3 Contr ol gr oup sheep’s ovar y and fetus

圖4 NCG組胎兒Fig.4 NCG gr oup fetuses

表2 妊娠0～38 d添加NCG對母羊妊娠第38天繁殖性能的影響Table 2 Reproductive performance on the 38th day of gestation of ewes fed a basal diet that was or was not supplemented with 0.11%NCG from days 0 to 38 of gestation

2.2 妊娠早期飼糧中添加NCG對胎兒發育的影響

與對照組相比（表3），在妊娠第38天時，NCG組活胎兒總重提高了71.13%（P＜0.05），活胎兒平均重降低4.70%（P＞0.05），胎兒體長減少0.16 cm，胎兒體高增加0.06 cm。說明妊娠早期飼糧中添加NCG后在增加胎兒數量的同時，并沒有影響胎兒的正常發育。

表3 妊娠0～38 d添加NCG對第38天胎兒發育的影響Table 3 Effects of NCG supplementation fr om 0 to 38 days of gestation on fetal development on the 38th day

2.3 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊血漿游離氨基酸濃度的影響

NCG組19 d的谷氨酸極顯著低于對照組（P＜0.01），甘氨酸、蛋氨酸、賴氨酸和精氨酸顯著高于對照組（P＜0.05），瓜氨酸和脯氨酸極顯著高于對照組（P＜0.01），鳥氨酸升高但差異不顯著（P＞0.05），天冬氨酸降低但差異不顯著（P＞0.05）；NCG組38 d的精氨酸和脯氨酸顯著高于對照組（P＜0.05），天冬氨酸、谷氨酸和鳥氨酸低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；NCG組19和38 d其他氨基酸與對照組差異不顯著（P＞0.05）。說明母羊妊娠早期飼糧中添加NCG后能夠影響母羊血漿中部分游離氨基酸的濃度（表4）。

表4 妊娠0～38 d飼糧添加0.11%NCG對母羊血漿游離氨基酸含量的影響Table 4 Effect of NCG supplementation between days 0-38 of gestation on concentration of free amino acids in the plasma of ewes on days 19 and 38 of gestation（μmol·L-1）

2.4 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊血漿NO、TNOS、eNOS和iNOS濃度的影響

妊娠第19和38天NCG組的NO濃度顯著高于對照組（P＜0.05）；妊娠第19和38天NCG組和對照組的TNOS濃度差異不顯著（P＞0.05）；妊娠19 d NCG組的iNOS和eNOS濃度顯著高于對照組（P＜0.05），妊娠38 d NCG組的iNOS和eNOS濃度極顯著高于對照組（P＜0.01）。說明妊娠早期飼糧中添加NCG后能夠顯著提高血漿中NO、eNOS和iNOS的濃度（表5）。

表5 妊娠0～38 d添加0.11%NCG對母羊血漿NO、TNOS、eNOS和iNOS濃度的影響Table 5 Effects of NCG supplementation between days 0 and 38 of gestation on concentrations of NO，TNOS，eNOS and iNOS in the plasma of ewes on days 19 and 38

2.5 血漿激素含量

與對照組相比，NCG組妊娠19 d母羊血漿中的孕酮濃度比對照組高0.89 ng·mL-1（P＜0.01），NCG組38 d母羊血漿中的孕酮以及妊娠19和38 d的母羊血漿中的雌二醇均比對照組高，但差異不顯著（P＞0.05）。說明妊娠早期飼糧中添加NCG后能夠增加妊娠第19天血漿孕酮的濃度（表6）。

表6 妊娠0～38 d添加0.11%NCG對母羊血漿雌二醇和孕酮濃度的影響Table 6 Effects of NCG supplementation between days 0-38 of gestation on concentr ations of estradiol and progester one in the plasma of ewes on days 19 and 38

3 討論

本研究結果表明，在妊娠早期的飼糧中添加0.11%NCG能夠顯著提高湖羊妊娠第38天的總胎兒數和活胎兒數，顯著提高胎兒形成指數，顯著增加活胎兒總重、胎水體積，能夠顯著增加精氨酸、脯氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等部分血漿游離氨基酸的濃度。本試驗中，NCG組的胎兒形成指數（0.86）比對照組的胎兒形成指數（0.60）高0.26（P＜0.05），說明NCG組的母羊人工授精后卵子受精、形成胚胎并發育成胎兒的能力比對照組強，添加NCG后提高了胚胎和胎兒的存活率，使NCG組胎兒的數量增加1只。母體營養是子宮內環境最主要的影響因素，給母體提供適宜的營養，有利于胚胎的生長發育［16］，同時對胚胎、胎兒的存活和生長發育也至關重要［17-20］。NCG是精氨酸體內合成途徑中關鍵酶CPS-1的有效激活劑，在體內能夠促進精氨酸合成［8］，使NCG組的精氨酸顯著高于對照組。精氨酸對動物機體有多種有益作用，能促進血管生成，改善氮代謝，促進泌乳和生長，增強動物繁殖和免疫能力［21］，對已建立的綿羊滋養外胚層細胞系的增殖、遷移和蛋白質合成具有促進作用［22-23］，血清中的精氨酸、脯氨酸濃度的增加可以為胚胎早期發育和植入提供足夠的營養，從而改善早期胚胎發育和著床［7］。在妊娠14～25 d給母豬添加0.4%和0.8%精氨酸分別使胎盤重量增加21%和34%（P＜0.01），每窩活胎數增加2個（P＜0.05），胚胎死亡率降低14%和15%（P＜0.01），使羊水總量極顯著增加（P＜0.01），提高了胚胎和胎兒的存活［24］；給多胎母羊注射精氨酸鹽能夠減少胚胎損失，增加羔羊的出生體重，提高胎羔的成活率［25-26］；Cai等［2］在妊娠早期母豬飼糧中添加NCG后顯著增加了每窩產活仔數（P＜0.05）；Zhu等［9］直接在妊娠0～28 d的母豬飼糧中添加0.05%NCG，NCG組妊娠第28天總胎兒數增加了1.32頭（P＜0.05），活胎兒數增加了1.29頭，胚胎死亡率降低11.8%（P＜0.05），胎盤總重和羊水總體積分別增加13%和18%（P＜0.05），活胎兒窩重比對照組高18%（P＜0.05），母豬妊娠第14和28天的血漿精氨酸和脯氨酸濃度顯著增加（P＜0.05），本試驗研究結果與以上報道的結果相一致。本試驗中在飼糧中添加NCG后，可能激活了CPS-1，促進了精氨酸的內源合成，使體內精氨酸的濃度升高，在精氨酸的作用下提高了胚胎和胎兒的存活率，從而提高了妊娠第38天的總胎兒數和活胎兒數。添加NCG后，還提高了妊娠19 d NCG組甘氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等部分血漿游離氨基酸的濃度，說明NCG還會影響NCG組其他氨基酸的代謝，具體原因有待進一步研究。

本研究發現，飼糧添加NCG能顯著提高母羊血漿中eNOS的含量和iNOS的活力，NCG組NO的濃度也顯著高于對照組。妊娠早期日糧中添加NCG會顯著增加母豬子宮內膜中eNOS蛋白和mRNA的表達量［9］，經產母豬整個妊娠期飼糧中添加NCG能有效提高妊娠母豬血漿中iNOS的濃度［27］，妊娠母豬飼糧中添加NCG提高了母豬血漿NO含量［9，27-28］，本試驗和這些結果類似。NO是由子宮內皮細胞產生的一種重要的舒張因子，能夠在胎盤和胎兒間的血流調控中發揮重要作用，因此，會在母體給胎兒提供養分和氧氣的過程中發揮重要的調控作用［29］，NO還通過重構細胞外基質調節胚胎著床［30］，在胎盤血管發育中起重要作用［31］，NO可誘導來自不同血管床的胎兒內皮細胞增殖［32-33］，并調節中心血管口徑［34］。研究結果已經表明，NO是胎盤血管生成、胎盤發育、胚胎發育和胎兒生長的重要調控因子［32-37］。動物體內的NO是由精氨酸在一氧化氮合成酶（NOS）參與下生成［38］，因此精氨酸濃度的高低是影響NO合成的重要因素，同時精氨酸的濃度也是影響血管平滑肌產生iNOS的關鍵因素［27］，本試驗中添加NCG組精氨酸濃度的顯著升高有助于NO的生成和NOS活力的提高。因此，精氨酸在一氧化氮合成酶的作用下提高了體循環中NO的含量，促進了胎盤血管生成和發育，增加了胎盤的血流量［27，31，39］，在促進胎盤發育的同時為胚胎著床、妊娠期胚胎發育、胎兒的存活與生長提供了最適的子宮環境，使胚胎和胎兒存活率提高，并促進了胎兒的發育，因此本研究中妊娠第38天的總胎兒數、活胎兒數和活胎兒總重增加。這可能是在妊娠早期飼糧中添加NCG后能夠改善綿羊繁殖性能的作用機理。

雌激素和孕激素是調控妊娠的主要激素，它們在卵細胞的轉運、內皮細胞的增殖和分化、子宮內皮細胞的蛻膜化以及胚胎的著床過程中都扮演著重要的調控作用，從而對于哺乳動物妊娠的建立和維持起著至關重要的作用。本試驗中NCG組妊娠19和38 d的孕酮均比對照組高，尤其是NCG組在妊娠19 d的孕酮顯著增加，因精氨酸也是一種激素促分泌素［40］，能夠促進激素的分泌，孕酮和雌激素等含量的變化與母羊胚胎著床和妊娠維持關系非常密切。本試驗中NCG組母羊的黃體數量均比對照組多，分泌的孕酮也多，使NCG組19 d時血漿中孕酮的含量顯著升高。妊娠初期，孕激素促進子宮內膜增生，使腺體發育、功能增強，從而有利于胚胎附植［41］。

4 結論

妊娠早期飼糧中添加NCG，提高了胚胎和胎兒的存活，增加了妊娠母羊第38天總胎兒的數量和活胎兒數量，改善了母羊的繁殖性能，其作用機制可能是NCG促進了母羊內源性精氨酸的合成，提高了母羊血漿精氨酸、NO和孕酮含量，改善了子宮內環境和營養供給，使之有利于胚胎著床和妊娠維持。