基于CNKI數據庫的禾草與非禾草內生真菌文獻計量分析

李淑琴，陳振江，陳泰祥，李秀璋，慕彪彪，李春杰*

（1.蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室，蘭州大學草地農業教育部工程研究中心，蘭州大學甘肅省西部草業技術創新中心，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州730020；2.青海大學畜牧獸醫科學院，青海省畜牧獸醫科學院，青海西寧810016；3.蘭州市生態林業試驗總場，甘肅 蘭州730085）

De Bary［1］于1866年最早提出內生菌（endophyte）的概念，用以區別植物表面的表生菌［1-2］，他將生活在植物組織內的微生物統稱為內生菌。1898年Vogl從黑麥草（Lolium perenne）種子內分離出來第一株內生真菌［3］，國內外學術界對于內生真菌的研究已經有一百多年的歷史，但直到八十年代初才開始被重視［4-5］。從目前的研究結果來看，內生真菌在植物體內普遍存在［2］，包括禾草［6-8］與非禾草［9-11］。

禾草內生真菌是指生長在禾本科草類植物體內并完成全部或大部分生活周期，但不導致禾草外部癥狀的一類真菌［12-13］，主要是指子囊菌綱（Ascomycetes），麥角菌科（Clavicipitaceae），瘤座菌族（Balansieae）的香柱菌屬（Epichlo?）［13-15］。主要通過種子進行垂直傳播而侵染新的宿主禾草，與禾草形成互惠共生的關系。李翠英［16］于1989年首次對31份高羊茅（Festuca arundanacea）和21份多年生黑麥草進行了內生真菌的檢測。后續我國學者對醉馬草（Achnatherum inebrians）、野大麥（Hordeum brevisubulatum）、鵝觀草（Roegneria kamoji）、雀麥草（Bromusjaponicus）和中華羊茅（Festuca elata）等禾草的Epichlo?屬內生真菌進行了一系列研究報道，主要集中在內生真菌多樣性、次生代謝產物、抗逆生物學以及生態學等方面。到目前為止，我國學者至少已經發現了21個屬，77種禾草中存在Epichlo?屬內生真菌［17］。Epichlo?屬內生真菌是一類特殊的微生物，一方面，在調節植株生長中發揮著重要作用，它可以促進禾草的生長，提高宿主禾草對多種非生物脅迫和生物脅迫的抗性［18-19］，例如，抗旱［20］、耐鹽［19］、耐金屬［21］、抗病［22］、抗蟲［23］等。另一方面，由于內生真菌能夠產生生物堿，主要有吲哚雙萜類（indolditerpenes），麥角堿類（ergot）、黑麥草堿（peramine）以及波胺（lolines），其中前兩種生物堿能夠對家畜產生毒性，引起取食了內生真菌侵染的禾草的家畜中毒，給畜牧業造成重大損失，影響草地畜牧業的健康發展。而波胺和黑麥草堿能夠對昆蟲產生毒性，提高了宿主植物的抗蟲性。

非禾草內生真菌對它們的宿主植物的生長發育同樣發揮著重要作用，非禾草內生真菌共生體同樣能夠提高宿主植物抗逆性。在非禾草中，內生真菌是某些特殊植物的營養來源，是植株正常生長發育、生殖發育必不可少的條件［24］，其次利用內生真菌生產植物原藥、功能化合物方面顯示出巨大潛力，以及內生真菌代謝產物可能具有抗菌活性［25］、抗腫瘤活性［26］、抗HIV活性［27］、抗氧化活性［28］等特點。例如紫杉醇，最初從短葉紅豆杉（Taxuschinensis）樹皮中分離出來，能阻止癌細胞的擴散，是一種著名的抗腫瘤劑，并經相關研究發現，可以利用內生真菌來合成紫杉醇，又因該方法生長速率高，培養條件易掌握，易獲得大量培養物而被廣泛關注［26，29-30］。

我國幅員遼闊，生態系統豐富多彩，空間格局復雜多樣，是世界上物種資源最豐富的國家。其中動物、植物、微生物以及環境所構成的生態系統中，微生物發揮著重要的調節作用，我國擁有豐富的草地資源，分布于東北平原、內蒙古高原、鄂爾多斯高原、黃土高原以及青藏高原等各類天然草地，約有4億hm2，占全國國土面積的41.7%［31］。內生真菌分布廣、種類多，普遍存在于每種植物中，此外內生真菌所產生的次生代謝物也是多種多樣，這對于內生真菌的研究和開發提供了巨大的空間。

近年來，大量相關科技文獻的涌現，使得文獻計量得到重視。文獻計量學是指利用科技文獻和信息科學，統計相關文獻的數據，并對其進行定量分析，來明確某一研究領域的發展趨勢，能夠為相關研究人員提供所在領域的發展現狀以及研究趨勢，能夠更好地為研究領域和研究方向的選擇提供參考。隨著科學研究和技術的不斷發展，內生真菌在農業科技應用、綠色農業生產等方面的重要性日益凸顯出來。我國在內生真菌方面發表了大量的研究論文，但到目前為止，缺乏對內生真菌以及禾草與非禾草內生真菌發展進程的差距相關文獻的系統解讀。因此，將基于CNKI數據庫對禾草Epichlo?屬內生真菌和非禾草內生真菌的文獻進行計量分析，以明確國內對內生真菌相關領域的研究熱點、研究空白、存在的問題以及與國際上內生真菌相關研究存在的差距，為內生真菌的進一步深入研究提供良好的借鑒與參考。

1 材料與方法

以中國知網數據庫（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）為數據來源，選用內生真菌為關鍵詞，發表年份為1999年10月31日—2019年10月31日，進行高級檢索，共檢索到相關的文獻5333篇，以此作為文獻數據來源，手動挑選與禾草Epichlo?屬內生真菌研究相關的論文，共挑選到377篇文獻。基于文獻計量法分析，從論文的發表年份、數量、發表期刊、文獻科研機構、所屬的學科、研究機構和關鍵詞詞頻等方面進行統計和比較［32］。其中，對于禾草內生真菌關鍵詞的統計與比較，利用Citespace對377篇的關鍵詞頻度進行分析，并構建關系圖。

2 結果與分析

2.1 全國禾草與非禾草內生真菌論文發表情況及分析

1999-2019 年，共檢索到內生真菌相關文獻5333篇，其中禾草內生真菌相關文獻377篇。內生真菌年發文量總體呈現不斷上升的趨勢（圖1），但禾草內生真菌的年發文量，變化趨勢較小，2014年以前整體呈現上升的趨勢，其中2015年達到峰值，年發文量為69篇。從2015年以后又呈現出逐漸降低的趨勢。擬合方程為y=2.1558x-4299.2，（其中x為發表文獻年份，y為年發文量），R2為0.6457，可表示發表年份與年發文量的關系。而非禾草內生真菌研究相關文獻在20年內發文量呈現較大幅度的增加，2016年以前呈現出線性增長的態勢，在2016年達到一個峰值，之后稍微有所降低。將非禾草內生真菌文獻數量根據所在年度進行數據擬合，得到的擬合方程為y=24.406x-48811，（其中x為發表文獻年份，y為年發文量），R2=0.9022，線性擬合程度較好，表明國內學術界對非禾草內生真菌研究的重視程度越來越明顯。從20年發文量來看，國內禾草內生真菌的發文數量遠遠小于非禾草內生真菌。

圖1 1999-2019年在CNKI數據庫中禾草內生真菌與非禾草內生真菌相關研究論文年發文量Fig.1 Annual publications of research paper s r elated to endophytic fungi of grass and endophytic fungi of non grass in CNKI database during 1999-2019

2.2 發文學科分布

對檢索出的5333篇內生真菌相關文獻按照一級學科進行分類的結果表明（表1），在生物、作物、中藥與方劑研究領域的學科分布相對較高，分別為21.62%，15.58%，14.16%，涉及的學科較為廣泛。其次377篇禾草內生真菌相關文獻按照一級學科分類的結果發現（表1），在作物、草學、生物、植物保護4個研究方向的論文分別占禾草內生真菌文獻總數的20.69%，18.83%，11.94%，10.34%。從以上結果可知，禾草內生真菌與非禾草內生真菌的學科分布在作物學和生物學中都有較大分布。禾草內生真菌的研究由于其宿主都為禾本科草類植物，且禾草內生真菌的有性態表現為香柱病菌，在草學學科和植物保護學科中有較大分布。而非禾草內生真菌的研究有很大一部分來源于次生代謝產物的藥物開發，因此在中藥與方劑學科中也有較大分布。

表1 1999-2019年期間在CNKI數據庫中關于內生真菌與禾草內生真菌相關研究論文的主要學科分布Table 1 Main discipline distribution of research paper s on endophyte and grass endophyte in CNKI database during 1999-2019

2.3 文獻期刊分析

對檢索到的5333篇內生真菌的文獻進行統計分析，其中發文期刊超過總文獻10%的有天然產物研究與開發、安徽農業科學、菌物學報以及中國中藥雜志（表2），其中禾草內生真菌的發文期刊主要分布在草業科學、草業學報、生態學報等雜志。由此可知，發文期刊種類較為狹小，內生真菌主要發文期刊基本為同一類型的期刊，反映了關于內生真菌的研究較為局限，存在較大的發展空間。

表2 1999-2019年期間在CNKI數據庫中內生真菌研究載文量排名前10位的期刊Table 2 Top 10 journals in the CNKI database for endophytic fungi research during 1999 to 2019

2.4 發文量前10位的科研機構或單位

對發文機構和單位統計分析（表3）發現：發文量排在前10位的機構或單位包括：西北農林科技大學、蘭州大學、云南大學、海南大學、南京師范大學、中山大學、浙江大學、南京農業大學、貴州大學和吉林農業大學，其中排在第1位的是西北農林科技大學，論文數量為240篇，占所有文獻的4.50%，其次是為蘭州大學，論文數量為126篇，占2.36%。關于發表禾草內生真菌的機構或單位，排名前兩位的分別為蘭州大學和南開大學，蘭州大學發表禾草內生真菌論文數量109篇，占86.51%。南開大學發表禾草內生真菌的論文占內生真菌論文總數的22.28%。非禾草內生真菌研究論文發文量較多的機構和單位研究機構主要包括西北農林科技大學、云南大學、海南大學和南京師范大學等。通過計量分析可知內生真菌的研究主要集中在一些高校，且非禾草內生真菌的研究機構相較于禾草內生真菌的研究機構廣泛。

表3 1999-2019年期間在CNKI數據中與內生真菌相關研究論文數量排名前10位的機構Table 3 Top 10 institutions in the number of papers related to endophytic fungi in CNKI data during 1999-2019

2.5 排名前7位的資助項目

各發表論文所獲得的資助項目（表4）表明，資助論文超過100篇的基金項目有3個，分別為：國家自然科學基金、國家重點基礎研究發展規劃以及國家高科技研究發展計劃。此外，高等學校博士學科點專項科研基金、國家科技支撐計劃、廣東省自然科學基金和海南省自然科學基金等也資助了一定數量內生真菌的研究。國家自然科學基金資助論文數量為1163篇，包括141篇禾草內生真菌論文，以及1022篇非禾草內生真菌論文，表明國家自然科學基金在我國內生真菌的研究發展上起著舉足輕重的地位。

表4 1999-2019年期間在CNKI數據庫中與內生真菌研究相關論文的主要基金項目Table 4 The main fund pr ojects of paper s related to endophyte r esearch in CNKI database dur ing 1999-2019

2.6 單篇論文被引次數排名前10位論文

在檢索到的5333篇關于內生真菌的研究論文中，被引頻次最高的論文為郭良棟［2］于2001年發表于《菌物系統》的《內生真菌研究進展》一文，被引頻次高達819次（表5）。其次為張集慧等［11］于1999年發表于《中國醫學科學院學報》的《蘭科藥用植物的5種內生真菌產生的植物激素》一文，被引頻次為446次。其他被引頻次較高的論文分別發表于《中草藥》《微生物通報》《中國藥學雜志》《西北植物學報》和《中山大學學報》等雜志。

表5 1999-2019年期間在CNKI數據庫中發表關于禾草內生真菌與非禾草內生真菌相關研究論文中單篇被引用次數排名前10位的論文Table 5 Top 10 papers on the number of citations of a single paper related to endophytic fungi of grass and endophytic fungi of non gr ass in CNKI database in 1999-2019

關于禾草內生真菌的研究論文，被引頻次最高的論文為南志標等［14］于2004年發表于《生態學報》的《禾草-內生真菌共生體在草地農業系統中的作用》一文，被引頻次為172次。其次為陳世蘋等［33］于2001年發表于《應用于環境生物學報》的《水分脅迫下內生真菌感染對黑麥草葉內保護酶系統活力的影響》一文，被引頻次為142次，其他被引頻次較高的論文分別發表于《江蘇農業科學》《植物生態學報》和《微生物學通報》等雜志。引用次數排名前10的禾草內生真菌研究論文中，有5篇是關于黑麥草內生真菌的研究，表明黑麥草內生真菌共生體是國內關于禾草內生真菌研究起步較早的共生體。

2.7 禾草內生真菌高頻關鍵詞

關鍵詞是對論文的研究內容、方法、對象等的高度總結，關鍵詞分布可知相關研究領域的研究熱點以及發展趨勢。利用Citespace軟件對377篇禾草內生真菌文獻的關鍵詞構建了知識圖譜，結果表明，目前國內關于禾草內生真菌的研究對象多集中在醉馬草、黑麥草、野大麥、高羊茅、羊草（Leymus chinensis）、中華羊茅等幾種禾草（圖2）。其他高頻詞包括了“抗逆性”和“多樣性”等，表明目前國內關于禾草共生體的研究多集中在禾草內生真菌共生體的生物抗逆和非生物抗逆機理，以產生生物堿的功能為研究基礎，通過菌株多樣性的研究篩選獲得優良的內生真菌菌株以及新的禾草-內生真菌共生體的挖掘。

圖2 1999-2019年期間在CNKI數據庫中與禾草內生真菌研究相關的高頻關鍵詞網絡關系圖Fig.2 Network diagram of high frequency keywords related to the study of endophytic fungi of grass in CNKI database during 1999-2019

3 討論與展望

文獻作為信息、科技的載體，其數量可反映研究人員對內生真菌相關研究領域的關注程度和投入程度，我國非禾草內生真菌年發文量遠大于禾草內生真菌，在國際上，關于禾草內生真菌的發文量在1996-2016年達到1042篇，其中我國含有66篇［32］，占到國內發文量的27.5%，對我國禾草內生真菌研究占有重要影響。本研究發現對于內生真菌的研究局限于少數幾個學科，急需更加深入地交叉研究以推動研究思維的變革和創新，來挖掘研究領域的巨大潛力。此外任何一個領域的研究都離不開國家的支持，而在內生真菌的研究上，尤其是禾草內生真菌，基金項目較為缺乏且研究機構較為集中，主要為西北地區，使得研究的廣度、深度都有待加強。2018年師茜等［32］基于Web of Science數據庫對禾草內生真菌研究論文進行計量分析，列出了引用頻次排名前10論文的關鍵詞，研究對象主要是醉馬草和羽茅（Achnatherum sibiricum），研究內容主要為內生真菌提高宿主植物的抗旱性、抗寒性、抗鹽性的生理生化機制，本研究發現與其較為一致。

在20年的研究中我國取得了巨大進展，發現了越來越多的Epichlo?屬［47-48］內生真菌，深入了解和認識到內生真菌的系統發育過程，分子生物學技術、基因組學、蛋白組學和代謝組學以及信息生物技術的應用加快了內生真菌的研究，其次內生真菌全基因族測序的測定，更是明確了次生代謝物多樣性及其基因的關系［49-50］。在目前，禾草內生真菌的研究主要集中在黑麥草、高羊茅等，對于其他菌株還需要深入研究其進化起源以及與宿主植物的關系［51-52］。我國加大了對禾草內生真菌多樣性的研究，但仍較為局限，且鑒定的精確度不高。其次，我國對于內生真菌的研究主要集中在內生真菌提高宿主對環境抗逆性的生理生化機制，以及生物堿對生態系統的影響和內生真菌所產生的次生代謝物的作用等方面。而在國際內生真菌的研究更多集中在內生真菌與寄主相互作用的分子機制，以及利用內生真菌來進行育種等方面［51］，并已經選育出禾草內生真菌共生體新品種并應用于市場，而我國起步較晚，投入程度還遠遠不夠。再者，利用內生真菌共生體所產生的次生代謝物將其開發成殺菌劑，殺蟲劑等，內生真菌共生體所產生的麥角新堿具有消炎、止痛等功效，可用于藥物的制作等［8］都具有巨大的研究潛力。

續表5 Continued Table 5

內生真菌是一類應用前景廣闊的資源微生物，從長春花（Catharanthus roseus）所分離出的內生真菌菌株中，可發現含有長春新堿成分，這種成分具有抗腫瘤活性，且對白血病具有顯著療效［41，53］。此外內生真菌可能通過分泌2，3-丁二醇以及類似物來調控擬南芥（Arabidopsis thaliana）自 身 合 成 生 長 素（auxin，IAA），調節生長素相關運輸蛋白運輸生長素到指定位置以促進擬南芥的生長［54］，在未來可以利用該特性開發生物菌肥，對提高品種及產量具有巨大潛力。一些內生真菌能夠產生細胞壁分解酶，能用于克服宿主防御異物的天然屏障，還可產生果膠酶等胞外酶［55］，產生較高的商業價值。植物內生真菌是一個特殊的真菌類群，而目前對于非禾草內生真菌的研究主要集中在藥用植物。近年來，我國已從數百種藥用植物中分離鑒定出大量的內生真菌，主要研究內生真菌對宿主的生長發育、種子萌發、有效成分積累等方面的作用［56-57］，但對于內生真菌與宿主相互關系的分子機制研究成果較少以及對于內生真菌的研究主要集中在實驗階段，實際應用還需深入研究和實踐。因此同樣要加強非禾草內生真菌的共生機制和抗逆機制的研究，加強內生真菌與藥用植物天然產物的研究，加強內生真菌同預防醫學、中醫藥學和林學等相關學科和團隊的研究。

內生真菌共生體對其他微生物同樣也產生一定影響，Márquez等［58］在研究中發現，只有被病毒感染的內生真菌才能提高寄主植物的耐熱性，這揭示了真菌病毒能影響內生真菌共生體系，但病毒對內生真菌以及共生體的影響仍不清晰。菌根真菌同樣能與植物根系建立互惠共生關系，而內生真菌與菌根真菌雙重感染時對寄主植物所產生的影響研究較為缺乏。有研究表明內生真菌與菌根真菌存在拮抗作用［59］，但在某些情況下反而促進菌根真菌的侵染［60］。兩種真菌是否形成雙重共生體以對寄主達到多方面的保護，仍需更深入的探索。因此對于我國內生真菌的相關研究需要加大投入，以不斷提升該領域的研究水平，推動我國內生真菌的發展。