貯藏年限對裸燕麥種帶真菌和真菌毒素的影響

聶秀美，慕平，趙桂琴，何海鵬，吳文斌，藺豆豆，蘇偉娟，張麗睿

（1.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州730070）

裸燕麥（Avena nuda）是禾本科燕麥屬一年生糧飼兼用作物，廣泛種植于我國華北和西北等半干旱地區，每年種植面積約60萬hm2［1-2］。研究表明，裸燕麥籽粒含有大量易消化和高熱量的營養物質，如粗蛋白（12%～18%）、粗脂肪（4%～6%）、礦物質和可溶性膳食纖維（11%～18%）等，能夠促進人體和畜禽腸道系統中有益菌的繁殖，調節血脂和血糖，改善血液循環等［3-4］。此外，燕麥籽粒因其粗蛋白、粗脂肪和可溶性糖含量高，難以消化的粗纖維含量低，是牛、馬等家畜補飼肥膘的優質飼料［5］。

隨著人們對裸燕麥種子保健功能認識的逐步提高，以及國家“糧改飼”“引草入田”和“草牧業”等重大政策的推行實施，燕麥種植面積和種子需求量不斷增加。種子在生產和貯藏過程中不可避免地會攜帶大量的真菌，這些真菌可通過自身的分解作用對種子中的有機物質進行消化、吸收和利用，導致種子劣變、縮短種子貯藏年限、增加病原菌傳播風險，甚至影響種子安全貯藏和幼苗健康［6-7］。此外，種子在貯藏過程中，大多數霉菌在適宜的生境下會代謝產生真菌毒素，長期攝入低含量毒素會引起代謝紊亂、免疫力下降以及皮膚、肝臟和胃腸道等的病變；短期內攝入毒素含量過高，可引起生殖毒性、細胞毒性、癌變和畸變等，對人畜健康具有極大威脅［8-9］。

據聯合國統計，全世界每年被真菌毒素污染的谷物占25%左右，即使某些種子外表未發現霉變，卻已被霉菌毒素侵染［10］。因此，種子帶菌是危害人畜健康和安全的一大因素，對種子攜帶的真菌和真菌毒素進行早期檢測至關重要。但截至目前，國內對裸燕麥種子的帶菌檢測僅見荊卓瓊等［11］通過形態學觀察，從2個裸燕麥品種中分離鑒定出11個屬的真菌；馬從［12］對甘肅省的2個裸燕麥品種通過形態學觀察檢出6屬14種真菌；聶秀美等［13］通過形態學和分子生物學鑒定，從不同產地的4份裸燕麥材料中分離出真菌13屬30種。而有關貯藏年限對裸燕麥種子在貯藏過程中受真菌污染、帶菌及產毒情況等方面的研究還尚未見報道。因此，本研究擬以3個主栽品種為研究對象，對其在貯藏期間所攜帶的真菌和其產生的毒性較強的真菌毒素進行檢測，以明確貯藏年限對裸燕麥種子帶菌情況和真菌毒素含量的影響，為裸燕麥種子的安全貯藏和生產利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試裸燕麥品種為白燕2號、壩莜9號和壩莜14號，于2017、2016、2015和2013年在甘肅省定西市通渭縣華家嶺鎮收獲，收獲的種子貯藏于甘肅農業大學牧草實訓基地種子室，種子貯藏期間的月均溫和月均相對濕度（用HC-520溫濕度測量儀記錄）（圖1）。試驗于2018年6月在甘肅農業大學草業學院實驗室進行，供試材料分別貯藏了1、2、3和5年。

圖1 種子貯藏期間的月均溫和月均相對濕度Fig.1 Monthly average temperature and relative humidity during seed storage

1.2 種子帶菌檢測

1.2.1 種子外部帶菌檢測 參照耿麗華等［7］和高葦等［14］的方法稍做改動后進行種子帶菌檢測。每個品種隨機取200粒完整種子分別放入50 mL滅菌三角瓶，加無菌水20 mL后于180 r·min-1的搖床上充分振蕩1 h。在無菌條件下吸取1 mL菌懸液均勻涂布到直徑90 mm的PDA（potato dextrose agar，馬鈴薯葡萄糖瓊脂）平板上（內加硫酸鏈霉素和卡那霉素各100 mg·L-1），每處理3個重復，涂布好的平板置于25℃恒溫培養箱中黑暗培養。從第3天起進行觀察，及時挑取菌落至新鮮PDA培養基上進行分離，對分離出的真菌進行純化和保存。待不再有新的菌落出現時，按稀釋倍數和檢測種子數計算孢子負荷量和檢出真菌的分離率。

1.2.2 種子內部帶菌檢測 每個品種隨機選取200粒完整種子，于超凈工作臺經75%酒精浸泡2 min，1%次氯酸鈉消毒5 min，無菌水漂洗4次，滅菌濾紙吸干種子表面的水分后，均勻擺放在90 mm的PDA培養基上（內加硫酸鏈霉素和卡那霉素各100 mg·L-1），每皿10粒，5皿為一重復，4次重復。置于25℃恒溫培養箱中黑暗培養。從第3天起進行觀察，及時挑取菌落至新鮮PDA培養基上進行分離、純化和保存。待不再有新的菌落出現時，統計帶菌種子數和帶某種真菌的種子數，并計算種子帶菌率和某菌分離率。

1.3 形態學鑒定

將分離純化出的真菌在25℃黑暗培養箱再次純化培養7 d后，參考《植物病原真菌學》［15］和《真菌分類學》［16］，用Revolve RVL-100-G顯微鏡觀察菌落和分生孢子的顏色、形狀和大小等形態學特征，進行初步鑒定。

1.4 分子生物學鑒定

采用Omega真菌基因組試劑盒提取菌株DNA。

利用真菌通用引物對ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行擴增。其中PCR反應體系為50μL：2×Taq PCR Master Mix 25μL，模板5μL，正反向引物各1μL，補充ddH2O至50μL。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環；72℃下延伸7 min。反應完成后，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測和紫外凝膠成像儀觀察，然后送樣進行測序及比對分析后，用Mega 7.0軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）構建系統發育樹。

1.5 真菌毒素含量的檢測

1.5.1 標準溶液的配制 細交鏈孢酮酸（tenuazonic acid，TeA）、黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）和桔青霉素（citrinin，CIT）3種真菌毒素（規格均為1 mg，純度＞99%）均用純甲醇溶解，配制成濃度均為100μg·mL-1的母液。吸取TeA、AFB1和CIT母液各500μL，配成濃度為500 ng·mL-1的TeA標準溶液、AFB1和CIT混合標準溶液，并用甲醇依次稀釋成濃度為100、50、20、8和0.4 ng·mL-1的標準溶液，存貯于-20℃冰箱中備用。

1.5.2 樣品處理 參照王芹等［17］和任貝貝［18］的方法，做適當改進后進行樣品中毒素含量的檢測。每份種子樣品稱取20.00 g（精確到0.01 g），經小型谷物粉碎機粉碎后各取5.00 g（精確到0.01g）于50 mL離心管，重復3次。各樣品加入30 mL乙腈-水溶液（84∶16，V∶V）經QL-866渦旋振蕩儀渦旋混勻后于室溫下浸泡1 h，30℃恒溫超聲30 min，10000 r·min-1離心10 min，取上清液25 mL于-20℃冰箱靜置3 h后，重新吸取上清液20 mL在50℃下經Christ RVC 2-33 IR真空離心濃縮儀濃縮至近干，殘渣加入乙腈-水（40∶60，V∶V）混合溶液1 mL，經渦旋振蕩儀混勻溶解后超聲5 min，經0.22μm有機濾膜過濾后用Agilent 1100高效液相色譜質譜儀（high performance liquid chromatography mass spectrometry，HPLC-MS）檢測。

1.6 數據分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據整理，用DNAStar軟件進行序列拼接、校對，在NCBI核酸數據庫中進行BLAST序列同源性比對分析，用Mega 7.0軟件構建系統發育樹，用SPSS 19.0進行方差分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 貯藏年限對裸燕麥種子帶菌量的影響

由表1可知，隨貯藏年限的變化，各供試種子外部的孢子負荷量差異較大，為0.60～8.40 cfu。其中白燕2號在貯藏5年時的孢子負荷量（1.57 cfu）最高，貯藏3年時僅有0.60 cfu，顯著低于其他年限（P＜0.05）。壩莜9號貯藏3年時的負荷量最高（4.17 cfu，P＜0.05），貯藏2年時的負荷量最低（1.73 cfu），較前者降低了58.51%。壩莜14號貯藏1年時的孢子負荷量為8.40 cfu，顯著高于其他年限（P＜0.05），且高于其他參試材料。

表1 不同貯藏年限裸燕麥種子的帶菌量Table 1 The amount of fungi in naked oat seeds with different stor age year s

各參試材料在不同貯藏年限的內部帶菌率存在明顯差異，隨貯藏年限的增加總體表現為下降趨勢。帶菌率變幅為2.75%～28.50%，其中白燕2號在貯藏1年時帶菌率最高，為6.00%（P＜0.05）。貯藏2年時壩莜9號帶菌率為28.50%，較貯藏1、3和5年分別增加了42.11%、70.18%和84.21%（P＜0.05），且高于其他材料。壩莜14號在貯藏1年時帶菌率最高，為20.25%，隨后顯著下降，貯藏5年時帶菌率最低（2.75%），較貯藏1年時降低了86.42%。

2.2 裸燕麥種帶真菌的鑒定

部分分離真菌的菌落、孢子形態特征及分子生物學鑒定結果如下：

AS2在PDA培養基上生長較快，直徑約62 mm，菌落隆起，呈粗絨狀，正面中央褐色至灰褐色，邊緣呈白色，背面黑褐色，邊緣褐色，具同心輪紋。分生孢子單生或串生，倒棍棒狀、倒梨形或橢圓形，淡黃褐色至褐色，具橫隔1～6個，縱隔0～3個，部分含有短喙，大小為（9.1～24.2）μm×（3.4～8.5）μm，根據形態特征可初步鑒定為細交鏈孢（Alternaria alternate，圖2）。進一步通過序列比對和構建系統進化樹發現，AS2與A.alternate（MK656442）聚在同一分支，說明二者親緣關系很近，由此鑒定為A.alternate。

圖2 細交鏈孢的形態特征及系統進化樹Fig.2 Morphological characteristics and phylogenetic tree of A.alternate

AS6在PDA培養基上生長迅速，3～4 d即可長滿整個平板，菌落呈絨毛狀或棉絮狀，正面初期白色，后中央為白色，邊緣呈淡黃色，背面呈黃褐色，具同心環。分生孢子單生，呈球形或近球形，褐色至深褐色，無隔膜，大小（11.6～14.6）μm×（10.6～13.8）μm，根據形態特征可初步鑒定為節菱孢菌（Arthrinium rasikravindrae，圖3）。進一步通過序列比對和構建系統進化樹發現，AS6與A.rasikravindrae（MF326617）聚在同一分支，說明二者親緣關系很近，由此鑒定為A.rasikravindrae。

圖3 節菱孢菌的形態特征及系統進化樹Fig.3 Morphological characteristics and phylogenetic tree of A.rasikravindrae

AS9在PDA培養基上生長較快，直徑約84 mm，菌落平坦干燥，呈粗粉狀，正面黃綠色，背面呈焦黃色。分生孢子單生，呈球形，黃綠色，無隔膜，大小為2.3～5.0μm，根據形態特征可初步鑒定為黃曲霉（Aspergillus flavus，圖4）。進一步通過序列比對和構建系統進化樹發現，AS9與A.flavus（MN095161）聚在同一分支，說明二者親緣關系很近，由此鑒定為A.flavus。

圖4 黃曲霉的形態特征及系統進化樹Fig.4 Morphological char acter istics and phylogenetic tr ee of A.flavus

AS17在PDA培養基上生長緩慢，直徑約15 mm，菌落稍隆起，中央有裂紋，呈粉狀，正面橄欖綠色，背面橄欖褐色。分生孢子單生，近球形或卵形，大小為（3.2～6.7）μm×（1.8～2.9）μm，根據形態特征可初步鑒定為枝細枝孢（Cladosporium ramotenellum，圖5）。進一步通過序列比對和構建系統進化樹發現，AS17與C.ramotenellum（MG548565）和C.ramotenellum（MH 383201）聚在同一分支，說明三者親緣關系很近，由此鑒定為C.ramotenellum。

圖5 枝細枝孢的形態特征及系統進化樹Fig.5 Morphological char acter istics and phylogenetic tr ee of C.ramotenellum

AS29在PDA培養基上生長緩慢，直徑約21 mm，菌落呈粉狀兼絨狀，正面初期藍綠色，具臍狀突起，背面中央淡紅褐色，邊緣奶黃色。分生孢子單生，呈球形，藍綠色，無隔膜，大小1.9～3.4μm，根據形態特征可初步鑒定為鮮綠青霉（Penicillium verrucosum，圖6）。進一步通過序列比對和構建系統進化樹發現，AS29與P.verrucosum（MH 860078）聚在同一分支，說明二者親緣關系很近，由此鑒定為P.verrucosum（圖6）。

圖6 鮮綠青霉的形態特征及系統進化樹Fig.6 Morphological characteristics and phylogenetic tree of P.verrucosum

AS32在PDA培養基上生長迅速，2～3 d即可長滿整個平板，菌落呈絲狀，正面初期乳白色，后期灰褐色。分生孢子單生，呈近球形或卵圓形，淡褐色，無隔膜，大小為（4.6～12.5）μm×（3.9～11.3）μm，根據形態特征可初步鑒定為米根霉（Rhizopus oryzae，圖7）。進一步通過序列比對和構建系統進化樹發現，AS32與R.oryzae（NR103595）聚在同一分支，說明二者親緣關系很近，由此鑒定為R.oryzae。

圖7 米根霉的形態特征及系統進化樹Fig.7 Morphological characteristics and phylogenetic tree of R.oryzae

2.3 貯藏年限對裸燕麥種子帶菌種類和分離率的影響

2.3.1 貯藏年限對裸燕麥種子外部帶菌種類和分離率的影響 從各供試裸燕麥種子表面共檢出真菌14屬29種（表2），其中細交鏈孢在11份樣品中檢出，檢出率為91.67%；其次是黃曲霉，檢出率為66.67%。帶菌種類最多的是貯藏1和5年的壩莜14號，均攜帶11種真菌；貯藏1年的白燕2號和貯藏3年的壩莜9號中真菌種類檢出數最少，均僅有4種。

表2 裸燕麥種子表面的帶菌種類和分離率Table 2 Fungal species and isolation rates of naked oat seeds surface（%）

白燕2號在貯藏2、3和5年時均能檢出的真菌有細交鏈孢、塔賓曲霉（Aspergillustubingensis）和米根霉，而雅致放射毛霉（Actinomucor elegans，19.92%）、枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides，57.93%）和疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria，11.64%）僅存在于貯藏1年的種子中；煙曲霉（Aspergillus fumigatu，4.86%）和黑附球菌（Epicoccum nigrum，4.31%）僅在貯藏2年時發現；蕓薹鏈格孢（Alternaria brassicae，13.33%）和黑曲霉（Aspergillusniger，12.04%）僅存在于貯藏3年的種子中；節菱孢菌（1.85%）僅在貯藏5年時檢出。蔥鏈格孢（Alternaria porri）、黃曲霉和擬孢鐮孢菌（Fusarium sporotrichioid es）僅在貯藏2和3年時分離出，產黃青霉（Penicillium chrysogenum）存在于貯藏3和5年的種子中。

壩莜9號在所有貯藏年限中均能檢出的真菌僅有細交鏈孢，而蕓薹鏈格孢（2.98%）、藜生鏈格孢（Alternaria chenopodiicola，19.16%）、蔥鏈格孢（12.01%）和楸子莖點霉（Didymella pomorum，1.39%）僅在貯藏1年時檢出；寄生曲霉（Aspergillus parasiticus，3.44%）、枝細枝孢（3.70%）和產黃青霉（21.18%）僅在貯藏2年的種子中分離出；阿姆斯特丹曲霉（Aspergillus amstelodami，0.90%）和煙曲霉（4.51%）僅存在于貯藏3年的種子中；黑曲霉（2.08%）、擬孢鐮孢菌（6.61%）和米根霉（1.04%）僅在貯藏5年時檢出；塔賓曲霉僅在貯藏1和2年時檢測出，謝瓦氏曲霉（Aspergilluschevalieri）在貯藏3和5年時檢出。

細交鏈孢在壩莜14號所有貯藏年限的樣品中均能檢出，而擬孢鐮孢菌（1.20%）和鮮綠青霉（20.58%）僅在貯藏1年時分離出；塔賓曲霉（5.25%）、黑附球菌（2.22%）和德氏霉菌（Pyrenophora chaetomioides，32.76%）僅存在于貯藏2年的種子中；黑曲霉（7.41%）和裂褶菌（Schizophyllum commune，3.70%）在貯藏3年時分離出；紅曲霉（Aspergillusruber，4.32%）、肉桂紫青霉（Penicillium cinnamopurpureum，1.08%）和米根霉（2.82%）僅在貯藏5年的樣品中檢出。蔥鏈格孢和木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）在貯藏1和2年時都有檢出，藜生鏈格孢和產黃青霉僅存在于貯藏2和3年的種子中，謝瓦氏曲霉和煙曲霉僅在貯藏3和5年時檢出。

2.3.2 貯藏年限對裸燕麥種子內部帶菌種類和分離率的影響 從不同貯藏年限的裸燕麥種子內部共檢出12屬23種真菌（表3），其中最多的是細交鏈孢（100.00%），次高的是蕓薹鏈格孢和黃曲霉，均為66.67%。貯藏1年的壩莜14號所攜帶的真菌種類最多，為10種；貯藏5年的壩莜14號僅有4種。

表3 裸燕麥種子內部的帶菌種類和分離率Table 3 Internal fungal species and isolation rates of naked oat seeds（%）

在不同貯藏年限的白燕2號種子內部都分離出了細交鏈孢和黃曲霉。黑曲霉和塔賓曲霉在貯藏2～5年時均可檢出，且其分離率在第3年時最大；而藜生鏈格孢（11.70%）、蔥鏈格孢（6.70%）和擬枝孢鐮孢菌（8.57%）僅在貯藏1年時檢測出；蕓薹鏈格孢（5.00%）僅從貯藏3年的種子中分離出，玉米平臍蠕孢（Bipolaris zeae，8.33%）和黑附球菌（6.25%）僅在貯藏5年時發現。在貯藏1和2年的種子中均可檢出的僅有枝狀枝孢菌。產黃青霉僅從貯藏2和3年時的種子中檢出。

壩莜9號在貯藏1年時的優勢菌為阿姆斯特丹曲霉（37.66%）；其他年限優勢菌均為細交鏈孢，分離率為18.59%～57.14%。所有樣品中均可檢出的真菌有細交鏈孢和德氏霉菌。貯藏2～5年時可檢出的僅有蕓薹鏈格孢。僅從貯藏1年的種子中檢測到的是擬枝孢鐮孢菌（13.90%）、楸子莖點霉（11.27%）、稻黑孢菌（Nigrospora oryzae，1.56%）和裂褶菌（1.32%）。僅在貯藏2年時檢測出的是玉米平臍蠕孢（20.77%）。蔥鏈格孢（7.67%）、煙曲霉（14.77%）、枝細枝孢（13.92%）和短密青霉（Penicillium brevicompactum，2.27%）僅從貯藏3年的種子中分離出，黑曲霉（5.00%）和枝狀枝孢菌（8.33%）僅在貯藏5年時發現。木賊鐮刀菌僅在貯藏1和2年時檢測出，藜生鏈格孢和產黃青霉僅在貯藏3和5年檢出。

壩莜14號在貯藏5年時種子內部分離率最高的是楸子莖點霉，為52.08%；其他年限分離率最高的均為細交鏈孢。不同貯藏年限共有的真菌有細交鏈孢、蕓薹鏈格孢和楸子莖點霉。貯藏1～3年的種子內部可檢出的僅有木賊鐮刀菌和德氏霉菌，而擬枝孢鐮孢菌（1.19%）、絲枝蠟蚧菌（Lecanicillium aphanocladii，3.41%）和稻黑孢菌（3.57%）僅在貯藏1年時檢測出；蔥鏈格孢（21.67%）僅在貯藏2年時檢測出；阿姆斯特丹曲霉（9.82%）和黃曲霉（1.13%）僅在貯藏3年的種子中分離出；謝瓦氏曲霉（14.58%）僅在貯藏5年時發現。在貯藏1和2年時均可分離出枝細枝孢，而貯藏2和3年時均可檢出的僅有藜生鏈格孢。

2.4 裸燕麥種帶真菌的系統發育樹

通過對裸燕麥種子上分離獲得的不同菌株的基因組DNA進行測序和同源性比對分析，發現各被鑒定菌株與其對應的比對菌株相似度均在97.00%以上。在NCBI數據庫提交被鑒定菌株AS1～AS33，獲得的菌株序列號為MT 503287～MT 503319。進一步構建系統發育樹（圖8），發現同一個屬的菌株基本都聚在一個較大的分支，不同屬的菌株單獨形成一支。共鑒定出17屬33種真菌，其中曲霉菌屬8種，青霉菌屬5種，鏈格孢屬4種，節凌孢屬（Arthrinium）1種、枝孢菌屬（Cladosporium）和鐮刀菌屬（Fusarium）各2種，德氏霉屬（Drechslera）、毛霉屬（Actinomucor）、蠕孢屬（Bipolaris）、亞隔孢殼屬（Didymella）、附球菌屬（Epicoccum）、裂褶菌屬（Schizophyllum）、蠟蚧菌屬（Lecanicillium）、漆斑菌屬（Myrothecium）、黑孢霉屬（Nigrospora）、莖點霉屬（Phoma）和根霉屬（Rhizopus）各1種。

圖8 裸燕麥種帶真菌的系統發育樹Fig.8 Phylogenetic tree of seed borne fungiof naked oat seeds

2.5 真菌毒素的線性方程、線性范圍和相關系數

通過對3種真菌毒素的標準樣品按500、100、50、20、8和0.4 ng·mL-1的濃度進行檢測表明，其線性關系良好，相關系數均在0.9995以上，各標樣的線性方程、線性范圍和相關系數見表4。

表4 真菌毒素的線性方程、線性范圍和相關系數Table 4 Linear equations，linear range and correlation coefficient of mycotoxin

2.6 貯藏年限對裸燕麥種子真菌毒素含量的影響

通過對不同貯藏年限裸燕麥種子的TeA、AFB1和CIT進行檢測表明，不同品種的毒素含量差異明顯，同一品種不同貯藏年限的毒素含量也有顯著差異（表5）。

表5 貯藏年限對裸燕麥種子真菌毒素含量的影響Table 5 Effect of stor age year s on mycotoxin content of naked oat seeds（μg·kg-1）

TeA含量隨貯藏年限的延長總體呈先升后降的趨勢，3個品種中壩莜9號的毒素含量相對最高。白燕2號貯藏2年時的TeA含量最高，為116.06μg·kg-1，顯著高于其他3個貯藏年限（P＜0.05）；貯藏1年時該毒素的檢出量最低（16.88μg·kg-1），且明顯低于其他材料。壩莜9號貯藏3年時該毒素的含量高達348.67μg·kg-1，是所有處理中最高的；但其在貯藏1年時檢出量（64.64μg·kg-1）最低，較貯藏3年時減少了81.46%。壩莜14號在貯藏2年時TeA的檢出量最高（123.52μg·kg-1），貯藏5年時其檢出量最低，為57.26μg·kg-1，較貯藏2年時下降了53.64%。

AFB1的變化因品種和貯藏年限而異。白燕2號貯藏1年時含量最高，為1.04μg·kg-1，是所有處理中最高的；隨后顯著下降，至貯藏5年時，該毒素的檢出量僅有0.02μg·kg-1，較貯藏1年時下降了98.08%。壩莜9號隨貯藏年限的延長其AFB1含量呈先升后降趨勢，貯藏2年時檢出量最高，為0.68μg·kg-1，隨后顯著下降，貯藏5年時降至最低（0.01μg·kg-1）。壩莜14號的AFB1含量隨貯藏年限的延長而下降，貯藏1年時的含量最高，為0.62 μg·kg-1，隨后急劇下降。

CIT含量隨貯藏年限的增加總體呈先升后降的趨勢，3個品種貯藏2年的CIT含量都顯著高于其他年限（P＜0.05）。白燕2號的CIT含量在貯藏2年后顯著下降，至貯藏5年時，該毒素的檢出量（0.08μg·kg-1）為所有處理中最低。壩莜9號在貯藏3年時的含量較貯藏2年時下降了91.91%。壩莜14號在貯藏3年時的含量最低（0.15 μg·kg-1），除與貯藏5年時該毒素的檢出量無明顯差異外，顯著低于其他年限（P＜0.05）。

3 討論

植物種子在生長、成熟、收獲和貯藏過程中，難以避免真菌入侵。本試驗中，不同貯藏年限參試樣品的帶菌量存在明顯差異，其帶菌量隨貯藏年限的延長總體呈降低趨勢，貯藏時間和品種對燕麥種子的帶菌量有顯著影響。這與陳燾等［19］對老芒麥（Elymus sibiricu）種子、雷玉明等［20］對河西走廊玉米（Zea mays）種子帶菌量的研究結果類似。金柳艷等［21］研究表明，玉米種子的孢子負荷量與帶菌率不具有明顯關聯性，乳熟期涿州種樣的孢子負荷量為1448 cfu，帶菌率僅有2.5%；完熟期蚌埠種樣的孢子負荷量高達1458 cfu，其帶菌率卻僅有10.0%；新鄭種樣的負荷量為275 cfu，其帶菌率卻達到了100.0%。本研究中，燕麥種子的孢子負荷量和帶菌率的表現趨勢也不一致，如白燕2號在貯藏5年時的孢子負荷量最高，但其帶菌率卻低于其他年限。貯藏2年的壩莜9號種子表面的負荷量在所有貯藏年限中最低，但其帶菌率卻最高。這可能跟貯藏時間、品種以及真菌寄生能力密切相關。剛收獲貯藏的種子很容易攜帶其母體及生長環境中的真菌體系，隨著貯藏時間的增加，帶菌量會因真菌的適應性而發生變化［22］；經收獲貯藏的種子，通常會處于休眠狀態而不能規避真菌的侵染，但隨著貯藏時間的延長，種子自身會逐漸解除休眠以抵御真菌的進一步污染［23］。岳曉禹等［24］對不同貯藏年限玉米樣品在貯藏過程中的霉菌群落研究表明，其真菌群落的變化與貯藏時間的相關性較強，貯藏1和3年的樣品中真菌群落差異明顯。前人對芝麻（Sesamum indicum）［25］和棉花（Gossypium hirsutum）種子［26］進行真菌檢測表明，種子外部和內部攜帶的真菌種類差異較大。本研究中，裸燕麥種子在不同貯藏年限下內部和外部的帶菌量和帶菌種類檢出情況差異顯著。所有參試品種中，白燕2號種子外部的孢子負荷量相對最少，但其帶菌種類卻較多；壩莜9號的種子內部帶菌率相對最高，但其帶菌種類卻較少。燕麥種子隨貯藏年限的變化其帶菌種類和分離率差異也很大，如壩莜9號在貯藏1年時，種子內部分離率最高的真菌為阿姆斯特丹曲霉（37.66%），其他年限最高的均為細交鏈孢，這跟楊顏霞等［27］對結縷草(Zoysia japonica)種子的研究結果類似。這可能跟種子在貯藏期間的自身防御能力和環境條件有關，不同真菌的侵染強度有所差異，而且同一品種在不同貯藏年份氣候因子間的差異也會影響真菌的存活力和繁殖率，進而影響對種子的侵染［11］。

不同品種在不同貯藏年限的種子外部和內部攜帶的優勢真菌種類存在明顯差異。如白燕2號貯藏1年時種子外部的優勢種為枝狀枝孢菌，2年時為擬孢鐮孢菌，在3和5年時均為細交鏈孢。壩莜9號貯藏1年時種子內部的優勢菌為阿姆斯特丹曲霉，其他貯藏年限卻是細交鏈孢。盡管優勢種不同，但優勢屬均為鏈格孢屬、曲霉屬和青霉屬。這和前人對三七（Panax notoginseng）［28］和紅豆草（Onobrychis viciaefolia）等［29］的種帶真菌研究結果類似。這主要是由于鏈格孢菌、青霉菌和曲霉菌等腐生菌的寄主范圍通常較廣，可通過侵染其母本植株、種子及田間雜草進行寄生，其孢子萌發和菌絲生長也相對較快，較有利于其在植物組織或器官侵染和傳播［30-31］。本研究發現，燕麥種子外部和內部的真菌情況有所不同，雅致放射毛霉、寄生曲霉、苜蓿莖點霉和米根霉等10種真菌僅在外部檢出，而玉米平臍蠕孢、絲枝蠟蚧菌、稻黑孢菌和短密青霉4種僅在內部檢出。共同攜帶的真菌有11種，但其在不同品種或在同一品種不同貯藏年限的分離情況差異也較大。這與趙輝等［25］對芝麻種子和先米西努爾·肉孜［32］對苜蓿（Medicago sativa）種子的研究結果類似，種子經消毒前后的真菌檢出情況存在明顯差異。這可能是由于某些真菌對次氯酸鈉的敏感性較強，外部消毒處理會破壞其生長環境（主要是適宜真菌生長的酸性環境）和降低活性，不利于其孢子的萌發和菌絲的生長發育，從而抑制真菌的生長繁殖。

對燕麥種子攜帶的優勢菌屬代謝產生的危害較大的3種毒素含量進行分析，發現各供試樣品均不同程度地受到3種毒素的污染，其中污染最重的是TeA，其次是CIT和AFB1。這主要是因為鏈格孢菌種類繁多、適應性強、繁殖力高、寄主范圍廣，95%以上的種都能在植物上寄生，特別是禾谷類農作物［33］。王曉紅等［34］對薏苡（Coix lacryma-jobi）仁在貯藏過程中的真菌毒素檢測表明，在貯藏0～30 d時AFB1含量很低，但在貯藏90 d時其含量明顯增加。羅曉楊［35］發現大多數材料的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和伏馬毒素（fumonisin，FB）含量隨貯藏時間的變化而變化，在貯藏前期呈降低趨勢，后期會增加或先增加后急劇下降，甚至反復反彈。本研究中，燕麥種子中真菌毒素檢出量差異顯著，隨貯藏年限的變化大多表現為先升后降的趨勢。真菌毒素含量在某一貯藏年份會顯著高于其他年份，很可能是由于這種毒素的大多數產毒真菌在這一貯藏時間達到了優良生長期，代謝量增大。不同燕麥品種種子的毒素含量差異顯著，同一品種在不同貯藏年限的毒素含量也有明顯差異。如白燕2號在貯藏1年時的AFB1含量最高，為1.04μg·kg-1，4年后下降至0.02μg·kg-1；白燕2號和壩莜9號在貯藏2年時的CIT含量顯著高于其他年限，但白燕2號在貯藏5年時該毒素的檢出量最低（0.08μg·kg-1），而壩莜9號在貯藏3年時的含量最低。這與劉冬梅等［36］對遠雜9102和豫花15花生（Arachis hypogaea）中毒素含量的研究結果類似，在相同的貯藏條件下，不同品種或同一品種的毒素檢出情況會因貯藏時間的長短而存在差異。本試驗中，燕麥種子在貯藏期間毒素含量的波動除與真菌自身的代謝狀況有關外，還可能與其所處的貯藏環境或其他微生物的分解作用有關。

李儉等［37］研究表明，玉米種子中的AFB1含量隨著生霉粒數量的增加呈現上升趨勢；而DON和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）含量則上下波動。盧洋等［38］也發現，玉米種子帶菌量的多少和毒素檢出量不相關，不能通過霉變量直接判斷種子中毒素含量的高低。本研究中，裸燕麥種子中真菌毒素含量的多少與帶菌量未表現出線性關系，如白燕2號在貯藏1年時的TeA含量顯著低于其他3個年限，僅有16.88μg·kg-1；但其帶菌率顯著高于其他年限，孢子負荷量也較高。貯藏3年的壩莜9號AFB1和CIT含量（分別為0.01μg·kg-1和0.11μg·kg-1）都低于其他處理，但其帶菌率和孢子負荷量（分別為8.50%和4.17 cfu）都較高。種子在貯藏過程中受真菌侵染的程度與貯藏環境、真菌自身的代謝狀況、真菌間的分解作用以及種子自身的生理機制等都有關系，且其產毒性能不具有均一性［39-40］。本研究中3種真菌毒素含量并未出現同時增加或降低的情況，這在一定程度上說明其產毒真菌并不是同時生長繁殖的，這很可能跟燕麥種子在貯藏期間攜帶真菌的多樣性較高，相互之間存在競爭性有關；而且除真菌外的其他微生物（細菌和放線菌等）及其代謝產物之間都可能發生拮抗作用而抑制某些真菌的產毒代謝活動。

4 結論

1）貯藏年限對裸燕麥種子的帶菌量、帶菌種類和分離率以及毒素含量都有顯著影響。帶菌量隨貯藏年限的延長逐漸下降，毒素含量呈先增后減的趨勢，帶菌種類和分離率因貯藏時間的不同差異明顯。

2）裸燕麥種子攜帶的優勢真菌屬為鏈格孢菌屬、曲霉菌屬和青霉菌屬，優勢種因貯藏時間和品種不同而異。

3）裸燕麥種子的帶菌量與帶菌種類、真菌毒素含量的多少無明顯相關性。