基于虛毒瘀病機(jī)理論探討細(xì)胞焦亡與肝癌關(guān)系*

張 振，曾普華，郜文輝，田雪飛△，田 莎，吳若霞，黃曉蒂，鄭 飄，黃 振，郭垠梅

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208； 2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006； 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208)

原發(fā)性肝癌(以下簡(jiǎn)稱“肝癌”)是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)2018年GOLOBAL CAN的統(tǒng)計(jì)，世界每年新增約84.1萬(wàn)例肝癌患者，死亡約78.2萬(wàn)例，嚴(yán)重威脅人民健康[1]。根據(jù)病理分型，肝癌可分為肝細(xì)胞肝癌(約占90%)、膽管細(xì)胞癌(約占 5%～10%)及混合型肝癌(約占5%～10%)[2]。目前，肝癌的研究多集中在細(xì)胞凋亡、自噬及血管新生等方面。近年來(lái)，隨著人們對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制研究的深入，細(xì)胞焦亡在肝癌發(fā)生發(fā)展及治療中的作用逐漸被揭示。

細(xì)胞焦亡是一種炎性相關(guān)性細(xì)胞程序性死亡方式，主要由半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)所介導(dǎo)。與細(xì)胞凋亡及壞死不同，細(xì)胞焦亡以胞膜穿孔、細(xì)胞腫脹破裂及大量炎性因子釋放為特征。有研究表明，細(xì)胞焦亡在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用[3]。本文擬從細(xì)胞焦亡角度，初步探討細(xì)胞焦亡與肝癌中醫(yī)病機(jī)聯(lián)系，為中西醫(yī)結(jié)合防治肝癌提供理論依據(jù)。

1 “虛、毒、瘀”是肝癌的主要病機(jī)

中醫(yī)對(duì)肝癌的認(rèn)識(shí)及防治源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。根據(jù)患者臨床癥狀及體征，肝癌屬于中醫(yī)學(xué)積聚、黃疽、鼓脹、肝水、脅痛等范疇。肝癌病因多樣，臨證繁多，病機(jī)復(fù)雜。肝癌患者常見納差、神疲、乏力、消瘦等“虛”證，其發(fā)展變化快、預(yù)后較差等，都屬于中醫(yī)“毒”或“癌毒”范疇。肝癌為有形之積，上腹腫塊、肝區(qū)固定疼痛是“瘀”的客觀表現(xiàn)。癌乃“因虛致癌”，先有正氣不足而后受外來(lái)邪毒侵襲，導(dǎo)致毒瘀互結(jié)而成，癌變進(jìn)一步發(fā)展使正氣更虛，從而又表現(xiàn)出“因癌致虛”的現(xiàn)象，正虛、邪毒、血瘀三者始終并存，互為因果，惡性循環(huán)，貫穿于肝癌整個(gè)病程中。

氣是維持機(jī)體正常生命活動(dòng)的運(yùn)動(dòng)不息的極細(xì)微物質(zhì)，在防御外邪入侵、維持臟腑功能正常運(yùn)行等方面起著重要作用，也是機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)、物質(zhì)及能量代謝的具體體現(xiàn)。當(dāng)人體正氣相對(duì)虛弱不足以抵抗外邪時(shí)，邪氣乘虛而入，導(dǎo)致臟腑氣血失調(diào)引發(fā)疾病。《外證醫(yī)案匯編》[4]有云：“正虛則為巖”。《本草綱目》[5]亦有云：“夫眾病積聚，皆起于虛也，虛生百病”，由此可見歷代醫(yī)家對(duì)惡性病病機(jī)的認(rèn)識(shí)多以正虛為主。李晶等認(rèn)為人體之氣具有識(shí)別異己的功能，腫瘤的發(fā)生與氣虛及其的功能失衡密切相關(guān)[6]。

肝癌的發(fā)生與癌毒密切相關(guān)[7]。肝癌發(fā)生的各階段癌毒所表現(xiàn)的形式不同：在癌前階段，癌毒是指能改變機(jī)體內(nèi)環(huán)境、引起原癌基因激活及抑癌基因抑制所有因素的總稱；在癌腫形成階段，癌毒是指促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的因素；肝癌后期，癌毒多是指以低氧、低PH值、高壓及大量炎性物質(zhì)等為特征的腫瘤微環(huán)境[8]。由此可見，癌毒既是特異性致病因子亦是病理產(chǎn)物。與火毒、濕毒、熱毒等相同，癌毒具有非物質(zhì)特征。癌毒的產(chǎn)生多與機(jī)體抗病能力下降、臟腑功能失調(diào)等有關(guān)。宋·楊士贏在《仁齋直指方論精要》[9]中說(shuō):“癌者，上高下深，巖穴之狀，顆顆累垂，毒根深藏，穿孔透里，男則多發(fā)于腹，女則多發(fā)于乳，或項(xiàng)或肩或臂，外癥令人昏迷。”認(rèn)為癌疾源于“毒根深藏”，并且具有“穿孔透里”的特點(diǎn)，提示癌疾具有侵襲性與轉(zhuǎn)移性的特點(diǎn)。

肝藏血，主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，“體陰而用陽(yáng)”。肝是保證機(jī)體血液正常運(yùn)行的重要臟腑。肝氣郁結(jié)，行血不暢，血液停積，聚于局部而形成瘀血。《素問·舉痛論篇》：“血?dú)饣舨坏眯校仕尬舳煞e矣”，即說(shuō)明血瘀是積聚形成之病機(jī)。《靈樞·邪氣臟腑病形》有載：“有所墮墜，惡血留內(nèi)；若有所大怒，氣上而不下，積于脅下，則傷肝”，說(shuō)明瘀血與肝臟關(guān)系密切。王清任《醫(yī)林改錯(cuò)·膈下逐瘀湯所治之癥目》[10]：“無(wú)論何處，皆有氣血……氣無(wú)形不能結(jié)塊，結(jié)塊者，必有形之血也。”又有“肚腹結(jié)塊，必有形之血凝聚”，說(shuō)明氣滯血瘀是形成肝癌的必要條件，氣行不暢、經(jīng)脈不通而致肝癌發(fā)生。

簡(jiǎn)言之，肝癌證屬于本虛標(biāo)實(shí)，正氣虧虛是本，癌毒與瘀邪相互搏結(jié)、聚于局部發(fā)為腫塊為標(biāo)。

2 細(xì)胞焦亡所產(chǎn)生各種炎性因子是肝癌“虛、毒、瘀”的微觀體現(xiàn)

細(xì)胞焦亡以調(diào)控炎性小體來(lái)實(shí)現(xiàn)。體內(nèi)外各種刺激，如細(xì)菌、病毒、藥物及衰老的細(xì)胞器、線粒體功能失衡等，均可誘導(dǎo)Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)的激活，NLRP3激活后，募集pro-Caspase-1及炎癥小體銜接子凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)形成炎性小體，并剪切pro-Caspase-1形成有活性的Caspase-1。Caspase-1一方面能刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β及IL-18的釋放，放大下游信號(hào)通路，增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)；另一方面切割Gasdermin E(GSDME)產(chǎn)生GSDME-N端，促進(jìn)細(xì)胞焦亡；同時(shí)使GSDME-N轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞裂解并釋放內(nèi)容物[11-14](如圖1)。

圖1 細(xì)胞焦亡機(jī)制

虛是以正氣不足為主要矛盾的病理反應(yīng)[15]。肝癌是一種炎癥相關(guān)性疾病，約有90%的肝癌由慢性病毒性肝炎、脂肪肝等引起[16]。有研究表明，肝癌的發(fā)生與機(jī)體免疫失衡密切相關(guān)，肝癌患者血清輔助性T細(xì)胞(Th)1相關(guān)細(xì)胞因子水平下降，Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平上升[17]。《素問·通評(píng)虛實(shí)論篇》有載：“邪氣盛則實(shí)，精氣奪則虛。”正常情況下，細(xì)胞焦亡過程中產(chǎn)生的各種炎性因子能清除癌細(xì)胞，促進(jìn)癌細(xì)胞裂解死亡。肝癌患者血清中NLRP3含量低于正常組織，使得肝癌患者體內(nèi)細(xì)胞焦亡下游信號(hào)通路激活受限，無(wú)法及時(shí)清除癌細(xì)胞[18]。有研究表明[18]，與正常肝組織相比，肝癌組織中的NLRP3明顯降低，從而降低肝癌細(xì)胞焦亡。由此可知，體內(nèi)炎性因子缺乏能導(dǎo)致臟腑虛弱，抗病能力低下，無(wú)法抵御邪氣并導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。

體內(nèi)各種引起腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的因素均屬于“癌毒”范疇。GSDME是抑癌基因P53的調(diào)控靶點(diǎn)，通常被認(rèn)為是一種潛在的抑癌基因。GSDME的激活能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及浸潤(rùn)[19]。肝癌組織中低表達(dá)狀態(tài)的GSDME，能促進(jìn)細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移[20]。IL-18屬于IL-1細(xì)胞因子超家族，是細(xì)胞焦亡的下游產(chǎn)物，能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞合成干擾素 (IFN) -γ，增強(qiáng)Th1型免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。與正常組織比較，肝癌組織中IL-18的表達(dá)明顯低于正常組織[21]，這些均提示細(xì)胞焦亡參與肝癌癌毒的形成。癌毒留于體內(nèi)久藏不去，日久耗傷人體正氣，使正氣更虛，正虛抗邪無(wú)力，則導(dǎo)致癌毒攻走流竄形成新的腫塊。

瘀是肝癌腫塊增長(zhǎng)過程中所形成的必然產(chǎn)物，亦是病因。肝癌患者體內(nèi)血液處于高凝狀態(tài)[22]。血液高凝、血行不暢形成瘀血，瘀血聚于局部則發(fā)為肝癌。細(xì)胞焦亡過程中產(chǎn)生的IL-1β，能夠上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞上的內(nèi)皮細(xì)胞膜組織因子、環(huán)氧化酶及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，并下調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白、內(nèi)皮細(xì)胞組織因子抑制物的表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體抗凝蛋白C系統(tǒng)的活性降低。此外，這些因子還能損害纖溶系統(tǒng)導(dǎo)致血栓形成。有學(xué)者認(rèn)為，患者血流動(dòng)力學(xué)改變及內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷是瘀的微觀體現(xiàn)[23-24]。

由此可知，細(xì)胞焦亡異常可以造成肝臟功能紊亂、氣血代謝障礙形成血瘀，瘀毒相互搏結(jié)聚于肝部形成肝癌(如圖2)。

圖2 細(xì)胞焦亡與肝癌病機(jī)聯(lián)系

3 細(xì)胞焦亡參與肝癌的形成與發(fā)展

細(xì)胞焦亡在肝癌的形成和發(fā)展階段起雙向調(diào)節(jié)作用。肝癌癌前病變期，細(xì)胞焦亡水平上調(diào)產(chǎn)生的炎性小體及炎性因子能促進(jìn)肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化；在肝癌形成以后，細(xì)胞焦亡水平下調(diào)，抑制肝癌細(xì)胞的裂解死亡，加速肝癌惡性程度[21]。

炎性小體的激活在細(xì)胞焦亡中起關(guān)鍵作用[25]。肝癌組織中，NLRP3炎性小體的表達(dá)顯著下調(diào)甚至缺失；且NLRP3炎性小體的表達(dá)與肝癌的病理分級(jí)和臨床分期呈負(fù)相關(guān)，這提示NLRP3炎性小體參與肝癌的發(fā)展[26]。激活的炎性小體將pro-Caspase-1剪切為有活性的Caspase-1。有研究表明，肝癌組織內(nèi)Caspase-1的表達(dá)明顯低于正常組織[27]。激活后的Caspase-1能刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β及IL-18。肝癌患者中細(xì)胞焦亡受到抑制，IL-1β及IL-18的表達(dá)水平低于正常人[21]。GSDME是焦亡下游產(chǎn)物之一。有學(xué)者比較了肝癌組織及正常組織中GSDME的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中GSDME的表達(dá)較正常細(xì)胞低，且GSDME表達(dá)的增加可有效抑制HepG2細(xì)胞增殖[28]。

4 基于“虛、毒、瘀”病機(jī)及細(xì)胞焦亡微觀聯(lián)系探索中醫(yī)藥治療肝癌新策略

辨證是中醫(yī)認(rèn)識(shí)疾病的基本原則之一。近年來(lái)，隨著細(xì)胞分子水平的發(fā)展，微觀辨證的概念應(yīng)運(yùn)而生[29]，并將傳統(tǒng)的辨證定義為宏觀辨證。

中醫(yī)藥治療肝癌具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，且能夠控制瘤體，具有減毒增效的作用[30]。前期的基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，肝癌的基本病機(jī)為“虛、毒、瘀”[7, 31]，采用益氣化瘀解毒法治療肝癌能提高患者半年、一年及兩年生存率，提高患者PFS[32]。益氣化瘀解毒中藥具有調(diào)節(jié)免疫、穩(wěn)定瘤體、下調(diào)VEGF表達(dá)、抗侵襲和轉(zhuǎn)移等作用[33]，同時(shí)益氣化瘀解毒中藥配伍能抑制人肝癌 HepG2細(xì)胞和裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，下調(diào)HIF-1α、VEGF及VEGFR-2、MMP-2、MMP-9等表達(dá)，抑制肝癌血管新生，阻斷細(xì)胞自噬流，并且可能通過干預(yù)HIF-1α、Twist1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、E-cad、PI3K、mTOR等相關(guān)指標(biāo)表達(dá)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[34-37]。

微觀辨證是利用現(xiàn)代信息技術(shù)，將細(xì)胞分子等現(xiàn)代生物信息知識(shí)引入中醫(yī)辨證體系。從中醫(yī)學(xué)角度出發(fā)，細(xì)胞焦亡是肝癌“虛、毒、瘀”的微觀體現(xiàn)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。清熱解毒類藥物黃連的有效成分黃連素，能激活肝癌細(xì)胞炎性小體，上調(diào)Caspase-1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞焦亡，抑制肝癌細(xì)胞的遷移和增殖[27]。因此，益氣化瘀解毒類中藥可能會(huì)通過影響細(xì)胞焦亡發(fā)揮抗肝癌作用。

在前期研究基礎(chǔ)上，本課題組將以益氣化瘀解毒為治法，從細(xì)胞焦亡及相關(guān)信號(hào)通路方面出發(fā)，進(jìn)一步探究中醫(yī)藥治療肝癌的機(jī)制，為中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌提供新的思路。