萊菔子配伍蒺藜對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用及機制研究*

李華妮，鄭連營，王艷艷，葛文靜，劉長河△

(1. 河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004； 2. 河南省兒童醫(yī)院、鄭州大學附屬兒童醫(yī)院、鄭州兒童醫(yī)院，鄭州 450003)

自發(fā)性高血壓是多種危險因素引起的心血管疾病，以體循環(huán)的動脈壓升高為主要特征，并伴有血液動力學異常、血管內(nèi)皮細胞損傷和血管結構改變等現(xiàn)象。高血壓可引起心臟等靶器官的損害，其對心肌細胞的結構和代謝都有一定的影響[1]。因此，降壓治療的目的不僅是有效控制血壓，還要對心臟等靶器官起保護作用。中藥復方具有良好的降壓作用，而且能減少靶器官的損害和預防并發(fā)癥，已經(jīng)成為防治高血壓的重要手段。萊菔子和蒺藜是中醫(yī)治療高血壓的常用中藥，臨床上二者常配伍使用。萊菔子性辛、甘、平，具有降氣化痰和消食除脹的功效。研究表明，萊菔子具有較好的降壓作用[2]，其有效成分主要是水溶性生物堿和芥子堿鹽類[3-6]。蒺藜性辛苦平，入肝經(jīng)，能平肝解郁、祛風明目，其活性成分主要是蒺藜皂苷類[7]，藥理作用主要為降壓、降脂、抗心肌缺血、改善心功能等[8-9]。本文前期研究了萊菔子配伍蒺藜對60例高血壓病患者的降壓作用，其降壓效果顯著。綜合前期的研究基礎，本實驗以SHR為研究對象，觀察萊菔子配伍蒺藜對SHR的血壓、血管活性物質(zhì)、心臟組織和胸主動脈血管的影響，試從動物實驗角度進一步闡明萊菔子配伍蒺藜的降壓機制及防治靶器官損傷的作用，為萊菔子配伍蒺藜的合理開發(fā)利用提供實驗基礎。本研究已通過河南省中醫(yī)藥大學倫理委員會審查。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)40只， 9周齡，體質(zhì)量190～200 g；SPF級雄性WKY大鼠8只，9周齡，體質(zhì)量200～208 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號SCXK(京)2016-0006。由河南省中醫(yī)藥研究院動物房喂養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度25 ℃，空氣濕度50%～70%，每3只大鼠1籠，大鼠可自由活動并自由攝取標準飼料與干凈自來水。動物在飼養(yǎng)室適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 實驗藥物

萊菔子和蒺藜藥材購自平頂山市仲華堂中藥飲片有限公司。取等量萊菔子和蒺藜藥材加入10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并煎煮液并濃縮至浸膏狀，然后將浸膏用0.1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液溶解，配成質(zhì)量濃度為2 g·mL-1的混懸液。馬來酸依那普利片(上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司，批號12112402，規(guī)格10 mg)，用0.1%CMC-Na水溶液溶解，配成質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

NO試劑盒(批號20180823)南京建成生物工程研究所；內(nèi)皮素-1(ET-1)試劑盒(L180817117)、血管緊張素(Ang Ⅱ)試劑盒(L181204321)、醛固酮(ALD)試劑盒(L181214591)，武漢云克隆科技股份有限公司； BP-2010 A型動物智能無創(chuàng)血壓儀，日本Softron 柱式會社；GT-350 W型超聲波提取器，濟寧科技超聲電子有限公司；ELx808酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；2K15型冷凍離心機，德國Sigma公司；CX31型顯微鏡，奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

40只SHR大鼠適應性喂養(yǎng)1周后正式實驗前進行血壓測量訓練，連續(xù)7 d，待大鼠血壓穩(wěn)定后，根據(jù)血壓分為模型組、馬來酸依那普利組、萊菔子組、蒺藜組、萊蒺組5組各8只。萊菔子組給藥劑量為20 g·kg-1，蒺藜組給藥劑量20 g·kg-1，萊菔子配伍蒺藜組由10 g·kg-1萊菔子和10 g·kg-1蒺藜調(diào)配而成，馬來酸依那普利組給藥劑量10 mg·kg-1，另取8只同周齡WKY大鼠為正常對照組。萊菔子組、蒺藜組、萊蒺組和馬來酸依那普利組每天灌胃給藥1次，劑量為10 mL·kg-1，模型組和正常對照組則分別給予等量的0.1% CMC-Na，連續(xù)給藥8周，每周測量大鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。

2.2 血壓測定

灌胃給藥后，每周采用智能無創(chuàng)血壓計測定各組大鼠清醒狀態(tài)下尾動脈血壓。測定血壓前先將待測大鼠在37 ℃恒溫室內(nèi)適應1 h，然后將大鼠固定在血壓計配套的保溫套內(nèi)，待大鼠安靜下來后，血壓檢測界面的脈搏波穩(wěn)定時開始測定血壓，連續(xù)測定3次，記錄大鼠收縮壓。

2.3 標本采集

末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，然后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL· kg-1)麻醉大鼠，待大鼠麻醉后經(jīng)腹主動脈取血，血樣3000 r/min-1離心10 min后取上清，-80 ℃保存樣品待測。ELISA法檢測血漿中NO、ET-1、Ang Ⅱ、ALD含量。取血后迅速取出大鼠的胸主動脈和心肌組織，用生理鹽水沖洗血污后，將胸主動脈和心肌組織放入4%多聚甲醛溶液中固定。

2.4 胸主動脈的形態(tài)學考察

取已固定好的胸主動脈和心肌組織使用梯度酒精依次脫水，二甲苯透明、石蠟包埋之后進行切片。胸主動脈進行常規(guī)切片，心肌組織進行橫切，然后使用二甲苯和梯度酒精分別進行脫蠟和脫水，蘇木素-伊紅染色后用中性樹膠封片，于×200倍鏡下觀察胸主動脈和心肌組織形態(tài)學變化并拍照。

2.5 數(shù)據(jù)收集情況

本課題灌胃給藥結束后共有5只大鼠出現(xiàn)死亡，經(jīng)解剖確認由灌胃造成死亡。除空白組8只大鼠存活，其他5組均為7只大鼠。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠血壓測定結果

表1示，給藥前，各組SHR大鼠血壓比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 模型組大鼠的收縮壓在給藥第3周時開始上升，萊菔子組、蒺藜組、萊菔子配伍蒺藜組大鼠的血壓相對穩(wěn)定，與模型組比較收縮壓明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中萊菔子配伍蒺藜組組降壓效果最明顯。

表1 萊菔子配伍蒺藜對SHR收縮壓的影響(mmHg)

3.2 各組大鼠血清中NO、ET-1、Ang Ⅱ、ALD含量比較

表2示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中ET-1、Ang Ⅱ、ALD含量升高，NO含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。萊菔子組、蒺藜組、萊菔子配伍蒺藜組均可降低自發(fā)性高血壓大鼠血清中ET-1、Ang Ⅱ、ALD含量，升高血清中NO含量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，且萊菔子配伍蒺藜后的效應優(yōu)于兩者單獨使用。

表2 萊菔子配伍蒺藜對SHR血清中NO、ET-1、Ang Ⅱ、ALD含量的影響

3.3 各組大鼠胸主動脈形態(tài)結構比較

圖1示，模型組SHR大鼠胸主動脈血管壁厚度(291.4±11.2) μm，給藥4周后，萊菔子組、蒺藜組、萊菔子配伍蒺藜組均能明顯降低SHR大鼠胸主動脈血管壁厚度，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且萊菔子配伍蒺藜組降低的更顯著。圖2示，正常對照組大鼠胸主動脈內(nèi)膜表面光滑，結構正常，彈力纖維排列有序。模型組SHR大鼠血管內(nèi)膜明顯增厚，結構較紊亂，內(nèi)皮層邊緣粗糙，中膜纖維組織增殖。與模型組比較，萊菔子組、蒺藜組、萊菔子配伍蒺藜組大鼠血管平滑肌增殖、內(nèi)膜增厚及邊緣粗糙均有不同程度改善，萊菔子配伍蒺藜組大鼠血管內(nèi)膜結構改善更明顯。

注：與正常對照組比較：a)P<0.01；與模型組比較：b)P<0.01；與萊菔子組比較：c)P<0.05，d)P<0.01；與蒺藜組比較：e)P<0.01圖1 萊菔子配伍蒺藜對SHR大鼠胸主動脈血管壁厚度的影響

圖2 萊菔子配伍蒺藜對SHR大鼠胸主動脈形態(tài)學影響比較(HE×400)

3.4 各組大鼠心肌組織形態(tài)比較

圖3示，正常對照組大鼠心肌細胞排列整齊，心肌橫紋清晰，細胞形態(tài)規(guī)則且間隙均勻。與正常對照組比較，模型組大鼠心肌細胞間隙增寬，形態(tài)不規(guī)則，肥大增生，心肌橫紋變得模糊。與模型組比較，萊菔子組、蒺藜組、萊菔子配伍蒺藜組大鼠心肌細胞形態(tài)規(guī)則，心肌橫紋變得清晰，且纖維組織增生也有一定改善，萊菔子配伍蒺藜組大鼠心肌結構改善更明顯。

4 討論

圖3 萊菔子配伍蒺藜對SHR大鼠心肌組織形態(tài)學影響比較(HE×400)

SHR大鼠是由血壓較高的WKY大鼠經(jīng)過選擇性近親交配20代而得到的高血壓大鼠品種，其血壓升高是由多基因遺傳因素決定[10-11]。SHR大鼠與人類高血壓有著相似的發(fā)病機制和并發(fā)癥，常用來研究原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制和篩選治療高血壓的藥物[12]。高血壓的發(fā)生發(fā)展是一個極其復雜的過程，機體血壓的穩(wěn)定和變化與血管中活性物質(zhì)水平息息相關。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)是高血壓發(fā)展過程中的重要體液調(diào)節(jié)因子[13]，在維持機體電解質(zhì)穩(wěn)定、調(diào)節(jié)血壓和調(diào)控心腎等靶器官功能方面發(fā)揮著重要作用，已成為高血壓治療的重要靶點。血管緊張素Ⅱ (Ang Ⅱ)是RAAS系統(tǒng)中的主要活性物質(zhì)，它通過與AT1受體結合，可強烈促進全身小動脈收縮而引起外周血管阻力增加，同時使交感神經(jīng)活性增強，刺激醛固酮的分泌，導致水鈉潴留繼而增加血容量。Ang Ⅱ還能通過與心臟成纖維細胞表面受體結合，增加成纖維細胞增殖，從而使心肌細胞發(fā)生病理性改變[14]。本實驗結果顯示，萊菔子配伍蒺藜能夠顯著降低大鼠血清中Ang Ⅱ和ALD水平，提示其可能對RAAS系統(tǒng)有一定的抑制作用。

血管結構的變化是高血壓病程進展中的重要病理改變，長期的壓力超載使血管壁張力持續(xù)升高，一方面導致血管收縮因子和血管舒張因子失衡引起內(nèi)皮功能障礙，另一方面可引起主動脈血管發(fā)生肥厚性重構[15]。ET是機體內(nèi)最強的縮血管物質(zhì)[13]，NO是內(nèi)源性的舒張因子，兩者水平能夠反映血管內(nèi)皮功能。高血壓患者血漿中的ET-1水平隨著血壓的增高而增高，并具有正相關特性[16-18]。本研究結果顯示，模型組大鼠血漿中ET-1水平明顯高于正常組，與以上結論符合。給藥后，各給藥組ET-1水平均有不同程度下降，NO水平顯著提高，提示萊菔子配伍蒺藜可以通過降低血漿中ET-1水平與提高NO水平改善內(nèi)皮功能損傷。

現(xiàn)代藥理學研究證明，萊菔子、蒺藜單味藥及其活性成分均有一定的降壓作用，萊菔子因含有水溶性生物堿和芥子堿鹽類而具有降壓作用。蒺藜因含有蒺藜皂苷類成分可調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)水平，不僅具有降壓作用，還具有降脂作用。兩者配伍之后能顯著降低SHR大鼠收縮壓的升高，改善SHR大鼠胸主動脈重構與心臟組織細胞形態(tài)，且配伍后的效果優(yōu)于兩者單獨使用。因此，兩者在降壓、改善SHR大鼠胸主動脈重構和心臟組織細胞形態(tài)方面具有協(xié)同作用。本文后期將對代謝異常引起的高血壓進行研究，如鹽誘導的高血壓、綜合飲食誘導的高血壓，為萊菔子配伍蒺藜在高血壓防治方面的應用提供參考。