高粱枯萎病生防菌株篩選研究

馬文旭，陳如男，劉新宇，李博浩，賈文寶，張嚴文，楊 雁，趙千慧，曹東歌，于高波，魏金鵬

(黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163319)

高粱是世界上重要的雜糧作物，常被用作制糖、釀酒等工業原料，是我國糧食化產業必不可少的農作物之一。而高粱病害是制約其產量的重要因素之一，高粱病害約有60余種[1]，發生較普遍的有15種[2]。其中由半裸鐮刀菌侵染引起的高粱枯萎病發生較為嚴重，在高粱生長到4～5片葉時即可發生，且為土傳病害。已有研究表明其致病菌為鐮刀菌屬，其可在土壤中傳播，通過高粱根系侵入其地上部分，導致高粱生長緩慢，葉片枯萎等，嚴重時可導致高粱產量顯著下降[3]。除此以外，孫紀申等[4]研究發現半裸鐮刀菌是高粱、小麥等糧食上常見的污染菌，其菌內含致癌物可致大鼠淋巴肉瘤和膀胱乳頭瘤，但能否引起人類腫瘤尚在研究。目前針對農作物病害的主要防治措施包括選育抗病品種、采用輪套作、使用化學農藥等方法，但抗病品種存在選育年限較長、品種適種地域有限的問題，輪作方式也存在時間周期長、經濟效益受影響等問題?；瘜W農藥在一定程度上能抑制植物病害的發生，賀新生等[5]發現克霉靈可有效抑制半裸鐮刀菌的菌絲體生長與孢子萌發，但是會產生農藥殘留危害與環境污染問題。而隨著人們的環境保護觀念越來越強，對綠色無公害、健康無污染農副產品的需求也越來越高。生物防治具有無毒、健康無污染等優點[6]，因此，采用生物防治實現綠色生產，為農業的可持續發展提供重要的保障。

事實上，生物防治已成為解決作物病害的重要防治方法之一。近年來關于高粱生防菌的研究也逐步增多，Sollepura等[7]篩選出20種具有生防潛力和促進高粱生長的內生真菌，姜鈺等[8]針對高粱靶斑病的生防防治開展了相關研究。對于鐮刀菌所引起的病害，在生防菌的研究方面有較多相關研究。已有研究發現對黃瓜枯萎病、西瓜枯萎病、番茄黃萎病等多種病原菌有抑制作用的生防菌株，季倩茹等[9]發現芽孢桿菌對黃瓜枯萎病具有良好的防病促生效果，但對于高粱枯萎病致病菌——半裸鐮刀菌的生防研究甚少。因此，高粱枯萎病的生防菌篩選及生物防治作用已成為高粱綠色生產亟待解決的關鍵問題。因此，本研究從黑龍江省大慶市的健康高粱根際土壤中篩選出33種具有拮抗效果的生防細菌，通過平板對峙試驗與盆栽接種試驗進行篩選，并對半裸鐮刀菌有良好生防效果的菌株進行分子鑒定及生防作用研究，以期為防治高粱枯萎病的菌劑研發奠定基礎，也為實現高粱的綠色生產提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料 克雜1號高粱品種，由國家雜糧工程技術研究中心提供。

1.1.2 供試菌株 病原菌：半裸鐮刀菌(Fusariumsemitectum)由黑龍江八一農墾大學臺蓮梅教授提供。生防菌：本試驗從黑龍江省大慶市的健康高粱根際土壤中分離純化，并經過初步的抑菌譜篩選出生防菌株33種。

1.1.3 供試培養基 PDA培養基，牛肉膏蛋白胨培養基。

1.2 方法

1.2.1 平板對峙法初篩生防菌 將半裸鐮刀病原菌活化，將直徑6 mm的菌碟置于平板培養基的中心，將生防菌菌液接種于平板1/4處，以單獨接種病原菌為對照，28℃下培養3 d，并進行多次重復，計算抑菌率，篩選抑菌效果較好的拮抗菌[10]。

抑菌率(%)=(對照病原菌半徑-生防菌對峙的病原菌半徑)/對照病原菌半徑×100

1.2.2 生防菌分子鑒定 將篩選出來的4種菌株通過細菌基因組試劑盒進行提取16SrDNA并進行PCR擴增，擴增引物為F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’與R:5’-TACCTTGTTACGACTT-3’，反應程序：94℃5 min；94℃1 min；72℃2 min；35Cycles；72℃7 min，4℃保存，電泳檢測，PCR產物測序，測序結果進行同源性比對(http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，選擇同源性99%以上的序列用MEGA7.0建立發育樹，確定菌株的種屬。

1.2.3 生防菌對高粱枯萎病影響的盆栽試驗 盆栽試驗設置6個處理，處理1：不接種任何菌種，只處理滅菌水為對照(CK)；處理2：單獨接種半裸鐮刀病菌(F)；處理3：接種生防菌Y+6后接種半裸鐮刀病菌(Y+6)；處理4：接種生防菌7后接種半裸鐮刀病菌(7)；處理5：接種生防菌Y+8后接種半裸鐮刀病菌(Y+8)；處理6：接種生防菌10+8-20后接種半裸鐮刀病菌(10+8-20)；每個處理3次重復，每個重復15株高粱。接菌方式為灌根處理(10 ml)：病原菌接菌采用半裸鐮刀病原菌孢子懸浮液(1×108cfu·mL-1)，生防菌采用生防菌菌液(OD600=0.7)。于高粱4片真葉時，CK與F處理采用蒸餾水灌根，其他4個處理分別接菌對應的生防菌，于生防菌接菌7d后，進行病原菌接菌，其中F只接種病原菌，其他4個處理同時接種生防菌與病原菌，發病后調查發病率與病情指數[10]。

病情指數=100×∑(各級病葉數×各級代表值)/(調查總葉數×最高級代表值)

發病率(%)=(染病株數/調查總株數)×100

1.2.4 植物細胞活性及活性氧檢測 H2O2采用DAB染色方法，ROS采用NBT染色方法，具體參考吳穎靜等方法[11]，Evans Blue染色參考劉楠等方法[12]。

1.2.5 防御酶活性測定 PAL活性參照He等方法，采用苯丙氨酸檢測方法，測定OD290吸光值[12]。PPO活性參照He等方法，采用鄰苯二酚方法，測定OD398吸光值[13]。

1.2.6 抗氧化酶活性測定 0.5 g高粱葉片50 mol·L-1用預冷PBS緩沖溶液研磨成勻漿， 12 000 r·min-1，4℃離心20 min，上清液即為抗氧化酶的粗酶液。SOD酶活性測定采用氮藍四唑法[14]，POD酶活性采用愈創木酚法，CAT、APX酶活性測定參照Zhang等的方法[15]。

1.2.7 土壤酶活性測定 高粱根際土樣收集利用抖落法取土，土壤脲酶、磷酸酶、多酚氧化酶、纖維素酶參照關松蔭土壤酶測定方法，分別采用比色法、磷酸苯二鈉比色法、鄰苯三酚比色法、硝基水楊酸法測定[16]。

1.2.8 數據與分析 采用Microsoft Excel(2016版)、mega 7.0、spss分析試驗數據，采用origin 75制作圖表。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的篩選

從33種細菌中篩選獲得17種細菌對半裸鐮刀菌具有較好抑制效果的菌株，其抑菌率均≥60%，并且病原菌菌絲體生長狀態、顏色、形態均與對照差異明顯。半裸鐮刀菌在正常生長下，菌體為黃白色，菌絲茂密，當與拮抗菌共同生長時，受拮抗菌影響，菌體顏色加深，而拮抗菌生長飽滿，具有良好的拮抗效果，且拮抗菌Y+6平板對峙試驗中出現明顯的抑菌圈(圖1，見241頁)。經過復篩后得到拮抗效果強且穩定的4種細菌：Y+6、7、Y+8、10+8-20，其抑菌率分別為89.33%、85.87%、83.55%、85%～87%(表1)。

表1 拮抗菌株的抑制率

2.2 拮抗菌的防病盆栽試驗

將平板對峙試驗篩選出來的拮抗菌進行盆栽接菌試驗，結果表明只接種病原菌的高粱植株(CK)在接菌3天后開始發生枯萎現象，而接種拮抗菌對枯萎病的發生有明顯的抑制效果，僅葉片有少許病斑，高粱仍然能夠正常生長。其中接種拮抗菌Y+8、7、10+8-20、Y+6的拮抗效果比較明顯，通過高粱枯萎病的發病率與病情指數調查發現其發病率分別為37.93%、30.77%、30.77%和42.33%，病情指數分別為16.92、30.77、22.12和18.97，顯著低于對照及其他處理，其具體病情指數與發病率詳見表2。由表2可知，Y+8、7、10+8-20、Y+6這4種拮抗菌接菌對高粱枯萎病的發生具有良好的抑制效果。

表2 拮抗菌株防治高粱的盆栽試驗

2.3 菌種分子鑒定

以上述篩選出的生防效果良好的4種菌株為樣本，通過測序獲得的16SrDNA序列，通過NCBI網站進行Blast序列比對并構建系統發育樹，如圖2。序列對比發現Y+8與短波單胞菌(Brevundimonas)的一致性達到100%，7和10+8-20與芽孢桿菌(Bacillus)的一致性達到99%，Y+6與Aquamicrobium達到98%，通過系統發育樹鑒定，Y+8為短波單胞菌、7為短小芽孢桿菌、10+8-20為芽孢桿菌、Y+6為Aquamicrobium。

2.4 生防菌接菌對高粱葉片活性氧的影響

2.5 生防菌接菌對高粱防御酶的影響

如圖5可知，病原菌接菌后(多酚氧化酶)高粱葉片的防御酶PAL(苯丙氨酸解氨酶)與PPO(多酚氧化酶)活性均顯著高于空白對照植株，且經生防菌Y+6、7、Y+8、10+8-20和病原菌接菌的高粱PPO酶的活性均顯著高于單獨病原菌接菌植株。如圖5所示，F、Y+6、7、Y+8、10+8-20處理的PPO防御酶活性分別提高了0.024、0.115、0.138、0.144、0.137 U·g-1·min-1，其中生防菌7、Y+8、10+8-20三者之間無明顯差異；PAL分別提高了0.227、0.32、0.553、0.207、0.453 U·g-1，其中生防菌7和10+8-20接菌的植株葉片PAL活性受到明顯的誘導，與單獨病原菌處理間差異達顯著性水平，而Y+6、Y+8處理與病原菌單獨處理的高粱植株之間無顯著差異。

2.6 生防菌接菌對高粱抗氧化酶的影響

通過測定高粱發病后抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX的活性，如圖6可知，與空白對照相比，病原菌接菌后植株的各抗氧化酶活性均顯著升高，且4種生防菌接菌后，各處理植株的POD酶活性均顯著高于單獨的病原菌接種植株。與單獨病原菌接種植株相比，生防菌Y+6、7、10+8-20接菌植株的SOD與APX酶活性也顯著提高。而CAT酶活性顯著降低，均顯著低于單獨的病原菌接菌植株，恢復至空白對照水平。其中單獨病原菌接菌高粱的POD酶活性相比較CK提高了9 U·g-1，生防菌接菌高粱分別提高了62.44、36.51、108.29、65.88 U·g-1。

2.7 生防菌對高粱根際土壤酶活性的影響

本試驗通過測定土壤脲酶、磷酸酶、多酚氧化酶、纖維素酶的酶活性來探討不同生防菌對高粱根際土壤的影響，由圖7可知，與空白對照相比，接菌病原菌后高粱根際土壤的4種土壤酶活性均顯著升高，且接菌生防菌Y+6、7、Y+8、10+8-20后4種土壤酶活性顯著高于單獨接種病原菌的植株根際土壤酶活性。其中Y+8處理的土壤脲酶活性最高，且顯著高于其他生防菌處理，10+8-20處理的根際土壤磷酸酶活性顯著高于其他生防菌處理，7處理的根際土壤纖維素酶活性顯著高于其他各生防菌處理，而多酚氧化酶在各生防菌處理之間差異未達顯著性水平。

3 討 論

本試驗分離鑒定出4株對高粱枯萎病有明顯拮抗效果的生防細菌(Aquamicrobium)、短小芽孢桿菌(Bacillus)、短波單胞菌(Brevundimonas)、芽孢桿菌(Bacillus)，并且通過調控高粱植株的抗氧化系統、防御酶系統以及高粱根際土壤酶活性等變化有效地抑制半裸鐮刀菌的生長及高粱枯萎病的發生。本研究篩選的4株拮抗細菌均能夠誘導高粱H2O2的產生，激活抗氧化系統，增強抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性以清除過量的活性氧，避免活性氧過度積累對植物造成損傷。劉麗霞等[17]關于擬南芥H2O2對大麗花黃萎病的早期防御反應的研究也表明，在植物病原體的向化作用下，活性氧有著多方面的作用，其不僅可激發植物的抗病系統，而且可誘導抗氧化酶活性的提高，清除活性氧，避免植株受到氧化脅迫損傷。

除此之外，本試驗還發現4種拮抗細菌在抑制高粱枯萎病發生的同時均能顯著提高其根際土壤的土壤酶活性，有助于良好的高粱根際土壤微生態環境的形成，為高粱生長創造更適宜的土壤環境條件。閆楊等[18]針對3株黃瓜枯萎病生防菌——芽孢桿菌的研究也發現生防菌的施入能夠明顯地提高黃瓜根際土壤磷酸酶、過氧化氫酶、脲酶等活性。本試驗施入4種生防菌后，高粱根際土壤的脲酶、磷酸酶、多酚氧化酶、纖維素酶的酶活性均有顯著的提高，與閆楊等的研究結果類似，說明生防菌還能通過提高土壤酶活性增強土壤肥力實現其防病促生作用。

在本試驗的相關研究中，4種生防菌株均能夠有效地提高抗氧化酶活性，很好地避免了活性氧的過量積累。其中“7”短小芽孢桿菌(Bacillus)與“10+8-20”芽孢桿菌(Bacillus)對植株抗氧化酶活性的促進效果與對枯萎病的生防效果最為明顯。也有研究發現，芽孢桿菌可對多種病害起到生防作用，其可有效抑制西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、黃瓜立枯病菌等枯萎病的發生[19]。另外，李新等[20]通過黃瓜枯萎病的研究也發現POD、SOD活性的變化與黃瓜的抗病性呈正相關關系，侯茜[21]、孫正祥[22]等對西瓜枯萎病的研究還發現，POD和CAT活性與植物的抗病性呈正相關，這與本試驗結果類似。另外，Xu等[23]關于花生白葉枯萎病的研究也發現，短小芽孢桿菌對枯萎病有顯著的抑菌活性，在田間試驗中達到65%以上，具有較好的生防作用。

已有研究表明，PAL和PPO活性可以作為反應植物抗病能力的主要生理指標，其中PPO可合成醌類物質使病原菌發生鈍化，在植物受到病原菌侵害時發揮著重要的作用[24]。另有黃瓜枯萎病的生物防治相關研究發現，接種芽孢桿菌后植株PAL、PPO酶活性顯著提高，促進了植物的生長和植物抗逆性的增強[9]。本試驗也發現，與單獨植物病原菌侵染相比，生防菌接種后植株的PAL、PPO酶活性均有顯著的提高，有助于高粱枯萎病抗性的增強。

4 結 論

本研究通過拮抗細菌與半裸鐮刀菌的拮抗試驗與接菌試驗，篩選并鑒定出4種拮抗細菌對半裸枯萎病有良好的生防效果，分別是Aquamicrobium、短小芽孢桿菌(Bacillus)、短波單胞菌(Brevundimonas)、芽孢桿菌(Bacillus),并且通過盆栽試驗證明，4種生防菌可以有效地抑制高粱枯萎病的發生，提高植株脅迫抗性，誘導植物產生防御反應并增強植株根際土壤酶活性來提高植物抗病性，從而有效控制高粱枯萎病的發生，在高粱枯萎病的生物防治中具有潛在的應用前景。