活性氧參與調控植物生長發育和脅迫應激響應機理的研究進展

祁偉亮，孫萬倉，馬 驪

(1.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070; 2.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070;3.甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅 蘭州 730070;4.甘肅省油菜工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070;5. 成都師范學院化學與生命科學學院，特色園藝生物資源開發與利用四川省高校重點實驗室，四川 成都 611130)

在全球氣候變暖的背景下，我國局部地區極易發生大面積、持久性或短時間內的極端天氣和氣候事件(霜凍、冷害和干旱等)，對作物(油菜、小麥、玉米等)的生長發育、產量和品質造成了嚴重影響[1]。但植物在漫長的進化過程中形成了一系列復雜且巧妙的機制來感知外部環境變化，從而激活相應的防御機制來適應環境選擇，這即是達爾文的“物競天擇，適者生存”法則。當植物受到脅迫時，植物通過細胞膜上特定的分子感知外部環境變化，并發出“警報”信號。隨后這些“警報”信號傳遞到細胞內部，最終到達細胞核，調節植物抗逆基因表達。但迄今為止，這種“警報”信息是什么，又是如何在細胞內傳遞尚不完全清楚。為此，當前的研究也迫切需要了解植物適應不利環境的分子響應機制，并通過分子育種提高作物的抗逆性和產量，有效緩解我國的糧食供給問題[2]。Gill和Tuteja[3]報道，脅迫誘導作物體內產生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，過量的ROS打破細胞內氧化平衡關系，對細胞有很強的毒害作用。但隨著對ROS的深入研究，人們發現適量的ROS對植物生長代謝也是有利的，還能作為關鍵信號分子激活第二信使、轉錄因子和改變酶活性來調控植物的生長發育[4]，以及調控自身的脅迫響應和防御系統。值得注意的是，ROS是否會作為細胞損傷或信號傳導因子，取決于ROS的產生與清除之間的平衡關系，而植物對ROS的清除能力也決定了植物細胞的抗逆防御能力。不難發現ROS似乎是一種“警報”信號，在植物信號傳遞及響應表達過程中扮演著重要的角色。那么細胞內、外的ROS來自于哪里？ROS信號又是怎么貫穿植物細胞進行信號傳導呢？ROS怎樣調控植物生長和形態建成，以及如何參與調控脅迫響應表達？ROS的信號傳導機制已成為生命科學領域研究的熱點課題，越來越多研究者選擇油菜[5]、小麥[6]、玉米[7]、馬鈴薯[8]、擬南芥[9]等進行系統研究，試圖回答上述問題并闡明ROS在植物體內的信號轉導機理。

近年來，關于ROS信號在植物體細胞的產生、信號傳導及響應表達和ROS引起的細胞程序性死亡的研究已取得了較大的進展，人們對ROS調控植物生長的作用及ROS信號在調控植物抗逆性的作用機理有了清晰的認識，但依然有很多問題沒有解決。因此，本文梳理了國內外關于ROS信號產生、傳導及響應表達機理的最新研究成果，為進一步了解植物保護策略和開發新的抗逆品種提供新觀點、新思路。

1 ROS來源機制

2 ROS的動態信號傳遞機制

3 ROS對植物生長發育的作用

3.1 ROS植物生長發育所必要的關鍵分子

3.2 ROS調控細胞的增殖與分化

細胞的增殖和分化是植物體內最基本的生命過程，而植物細胞體積或數目變化不僅依賴細胞壁的重建，也依賴于細胞壁聚合物網絡變軟[54]。Fry[55]研究發現，ROS能降解細胞壁多糖(如果膠和葡聚糖)，從而導致細胞壁比較疏松，有利于細胞的分裂，該觀點也在玉米胚芽鞘的伸展研究中得到證明[56]。Potikha等[39]在棉花纖維發育過程中檢測到H2O2的產生，并且發現H2O2產生的時間與細胞壁開始沉積時間一致，若抑制或清除H2O2的產生則阻止細胞次生壁的形成，而外源H2O2則能促進細胞次生壁的形成[57]。丁曉艷[58]研究發現蔗糖濃度的提高加強了ROS的生成，進而促進了棉花纖維起始和早期伸長，最終導致次生壁增厚信號提前和棉花纖維變短等現象 。以上研究為人們加強認識植物細胞增殖與分化過程中ROS在參與細胞壁重建和疏松過程中的作用提供了直接的證據。

4 ROS介導的抗逆防御反應

4.1 ROS參與MAPK級聯反應

大量證據證明，冷和干旱等脅迫可誘導植物細胞中產生ROS。一方面ROS通過其強大的氧化特性引起不可逆的細胞損傷，促進植物形態結構的改變，增強抗性；另一方面，ROS作為信號分子在介導防御反應、環境適應、細胞程序性死亡以及生長發育過程中扮演著重要角色。如細胞外ROS可通過水通道蛋白、未知受體或類蛋白激酶(Like protein kinases，RLK)感知并傳導信號[74]。在細胞內ROS信號被一個或多個未知的整合節點(X，Y)和細胞內細胞器(線粒體，過氧化物酶體，葉綠體)整合。整合因子Y作用于轉錄因子，并調控相關基因的表達，這僅僅局限于一種假設(圖5)。但是隨著ROS信號傳導機制的深入研究，一些未解之謎也越來越清楚。研究發現，ROS與Ca2+、MAPK、轉錄因子(ZAR、RAV、bZIP、WRKY、GRAS和Myb家族等)等關鍵分子存在明顯的相互作用[75]，其中MAPK級聯激活是多種信號通路的中心，是信號接收、轉換與傳入細胞核內的一類重要分子[76]。

在未受刺激的細胞內，MAPK處于靜止狀態，而細胞受到其他因素刺激后MAPK接收MKK和MKKK的活化信號而被激活，表現為逐級磷酸化。 MAPK活性增加的一個重要原因是ROS 的二次產生或氧化還原反應。如ROS傳導的下游信號涉及Ca2+和Ca2+結合蛋白，G蛋白、磷脂酶信號(PLC/PLD)的激活并導致磷脂酸(PA)的積累[77]。PA和Ca2+在激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Oxidative signal inducible 1, OXI1)中扮演著重要的作用。OXI1又可激活蛋白激酶(MAPK)級聯反應(MAPK3/6)[76]，進而影響了植株的抗逆性[78]。研究報道，在擬南芥中與氧化應激信號最相關的MAPK是MPK3/6[79]，在長時間脅迫下可持續激活MPK3/6，會進一步誘導細胞死亡，但MKP2可作為抑制因素能顯著延長MPK3/6激活，能積極調節細胞的氧化應激反應。朱健康研究組通過定量磷酸化蛋白組學分析發現：低溫處理下，MPK3/6蛋白磷酸化水平明顯升高[80]；同時，楊淑華研究團隊利用酵母雙雜交系統證實，MPK3/6蛋白能與ICE1互作[81]，這些結果暗示ROS、MPK3/6可能通過信號互作作用于ICE1在植物低溫應答過程中發揮重要作用。同時在植物體內外源H2O2也可激活MPK1和MPK2[82]、MPK4[83]和MPK7[79]，從而啟動植物的抗逆反應。陸俊杏等[84]研究證明，H2O2可誘導甘藍型冬油菜BnMAPK1基因顯著上調，而BnMAPK1基因的過表達可有效地提高甘藍型油菜菌核病抗性和抗旱性[85]。低溫馴化均可以增強植物應對冷害能力，原因在于馴化誘導提高了植物中質外體ROS的積累，增加了氧化酶和抗氧化酶活性，隨后H2O2激活MPK1/2來誘導脅迫響應[86]。

越來越多的證據表明，轉錄因子在植物逆境響應中扮演著十分重要的角色，ROS 主要通過提高轉錄因子表達量、增強轉錄因子結合DNA 能力等方面，進一步調節逆境響應相關基因表達, 改善植物抗逆性[87]。如擬南芥中WRKY家族轉錄因子WRKY33是MAPK3/6的直接磷酸化靶標[88]，在逆境脅迫中會導致WRKY33基因的上調表達，以提高植物的抗逆性[89]。在油菜抗寒性研究中也發現，抗寒性強的品種轉錄因子RRTF1(氧化還原反應轉錄因子1)是氧化還原信號網絡的核心組成部分，植物中升高的RRTF1水平導致ROS積累，這表明RRTF1在脅迫下可以放大ROS信號的形成，以誘導下游級聯反應[90]。水稻中轉錄因子OsNAC2能夠結合到ROS 清除基因OsCOX11 (Cytochrome c oxidase 11)的啟動子上并促進其轉錄, 大量表達的OsCOX11能夠清除逆境下積累的ROS, 提高水稻的鹽脅迫耐受能力[91]。綜上所述，證明ROS與轉錄因子等關鍵分子彼此間互作調控其基因表達，以此來幫助植物參與各種脅迫的防御反應(圖5)[92]。

4.2 ROS與MAPK信號途徑及植物激素途徑(ABA、BR等)存在廣泛的互作關系

ROS還能與其它信號分子互作形成一個復雜的反應網絡，從而使植物積極、高效地應對各種內在或外源的刺激信號，以調控植物的生長發育。如植物在受到冷害、高溫等脅迫時，植物體內會發生ROS爆發、同時積累較多的脫落酸(ABA)和油菜素類固醇(BRs)等激素[92]。隨著遺傳學、分子生物學、生物化學及細胞學等應用學科的發展，研究也證明ROS可與ABA、BR等相互作用，共同調控植物氣孔關閉以適應各種脅迫反應[93]。

研究發現，ABA在轉錄水平上會激活MAPK信號級聯途徑[94]，如豌豆中的PsMAPK[95]、擬南芥中的MPK3/6和MPK9/12[96]參與調控氣孔關閉和ROS的產生，而積累較多的ROS又作為信號分子進一步提高CAT等抗氧化酶活性，有助于增強甘薯[97]、玉米[98]的抗旱性以及水稻[99]、冬油菜幼苗[100]的抗冷性。研究人員對ROS參與ABA調控氣孔關閉機理進行了深入解析，發現保衛細胞中的PYR/ PYL/ PCAR是ABA信號受體，然后PYLs 構象發生改變并與PP2C(負調控因子)相互作用達到抑制PP2C酶活性的作用，進而激活SnRK2(正調控因子)激酶OST1蛋白的活性[101]，OST1又作為重要因子可激活NADPH酶產生較多的ROS，以激活離子通道促使陰離子外流和K+、Ca2+內流，最終促使氣孔關閉(圖6)。最新研究發現，ABA可激活L-半胱氨酸脫巰基酶(L-cysteine desulfhydrase，DES1)，當DES1被硫化氫激活后在Cys44以及Cys205氨基酸位置上發生自我硫巰基化，進而在保衛細胞產生大量的硫化氫，較多的硫化氫對RBOHD的Cys 825和Cys890進行硫巰基化修飾(圖6)，從而增強其產生ROS的能力以及ABA介導氣孔關閉的相關生理反應[102]，該研究也進一步加強了ROS參與ABA調控氣孔關閉機理認識。

在番茄氣孔的研宄中表明，BR與ROS也參與調控氣孔運動，低濃度BR誘導保衛細胞產生瞬時H2O2，使得細胞的氧化還原狀態發生改變，從而導致氣孔開放[70]。而較高濃度的BR和H2O2則可以調控氣孔的關閉[103]。為了進一步證明ROS與激素(ABA、BR等)協同調控氣孔關閉過程的觀點。研究者在外施ABA或BR之前，先用還原性試劑DPI(DPI可以抑制NADPH氧化酶的活性)處理材料30min[104]，結果顯示細胞內及氣孔保衛細胞中的H2O2熒光信號明顯下降，且氣孔關閉過程也明顯被抑制，這也證明了ROS參與ABA或BR等激素信號途徑并誘導氣孔關閉的觀點。后期的研究發現，ABA和BR誘導的氣孔關閉程度存在差異性[105]，如BR引起的氣孔關閉度小于ABA，而外施ABA后進而形成ABA正向放大環，促進氣孔關閉[70]。綜上研究進一步暗示ROS與MAPK信號途徑及植物激素途徑(ABA、BR等)存在廣泛的互作關系，它們通過復雜且巧妙的網絡調控體系，在一定程度上可以協調植物生長發育過程中所遇到的各種問題，但對于其復雜的調控體系依然需要后續的深入解析。

5 過量的ROS不利于植物生長發育

5.1 ROS的清除機制

適量的ROS對植物的正常生長和發育具有重要意義，這種作用取決于ROS的產生強度、時間與ROS清除之間的平衡關系。植物細胞中 ROS 清除的主要酶促清除系統有SOD、CAT、POD、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、胱甘肽還原酶(GR)等；非酶促系統如，谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(AsA)及酚類化合物[106](圖7a)。植物體在受到輕度脅迫時，這些抗氧化酶的活性會發生相應的變化，共同參與調控 ROS 自由基代謝，保護植物免受環境脅迫的危害，在油菜[107]、水稻[108]等作物研究中已得到充分證明，抗性強的材料抗氧化酶的活性顯著高于抗性弱的材料。孫萬倉課題組通過建立強抗寒冬油菜和弱抗寒冬油菜的雜交后代進行越冬率和保護酶活性變化規律分析，并建立回歸方程Y=1.208+2.698X1+1.154X2+0.163X3[109]，可得出越冬率與CAT 酶、POD 酶、SOD 酶活性的關系呈極顯著正相關，說明保護性酶活性越強，越冬率越高，抗寒性也就越好。通過PCR分析，進一步證明強抗寒性品種的Cu/Zn-SOD基因表達量顯著高于抗寒性弱的品種，而Cu/Zn-SOD基因被激活表達，誘導SOD 酶活性增加，有效清除體內的氧自由基，保護了細胞膜結構[110]。若植物處于深度脅迫時，機體內 ROS 清除機制功能異常，多種來源的ROS過度積累導致防御系統崩潰、ROS爆發[111](圖7a)。一方面ROS會與磷脂、膜受體蛋白發生脂質過氧化反應，嚴重破壞膜系統的完整性和流動性[112]，OH·可直接作用于脂類形成氫過氧化物，進而分解為 MDA等強毒力的脂質過氧化終產物，這些產物能交聯核酸、脂類、蛋白質及糖類，因此 MDA 的含量常被用來表征植物遭受逆境脅迫的危害程度[22]。另一方面過量的 ROS損傷周圍其他細胞，破壞細胞結構，包括染色質凝聚、葉綠體破壞、線粒體腫脹、DNA分裂(梯子)、tunel陽性細胞核和凋亡體形成[113]，最終導致細胞程序性死亡。

5.2 植物細胞程序性死亡與線粒體的關系

程序性細胞死亡(Programmed cell death, PCD)是一個高度有序和基因調控細胞自我死亡的過程。在生理生化上PCD常伴隨著呼吸速率和ATP合成的降低、ROS在線粒體內急劇增加、線粒體膜電位的改變和線粒體通透性轉換孔蛋白的完全開放等[114]。研究報道，線粒體孔蛋白(VDAC)是線粒體介導PCD的關鍵分子[115]，從真菌到動物和植物的所有生物體中都存在(圖8)。基因組序列分析顯示，在釀酒酵母中有兩個VDAC基因；擬南芥中存在5種VDAC亞型[116]。至少有3種亞型存在于水稻和煙草中[117]。在荷花和苜蓿中發現了5種不同的VDACs[116,118]。迄今為止，VDAC亞型已在玉米、小麥和油菜中也得到鑒定[119]。VDAC位于線粒體外膜，作為線粒體代謝物進出的看門者，VDACs被認為在線粒體和細胞質之間的代謝物運輸的調節中起作用[120]。VDAC也被認為是ROS從細胞內向胞質釋放的中介物之一[121](圖8)。ROS的過量產生伴有VDAC上調，VDAC通道切換至閉合狀態[122]，過量的ROS引發膜脂過氧化加劇，使線粒體膜通透性發生改變，促使Cyto c等凋亡因子的釋放，觸發PCD。非生物脅迫，包括冷脅迫、干旱脅迫、鹽堿脅迫等會導致ROS的產生，同時VDAC基因在脅迫下的差異表達已有報道[123]。通過RT-PCR方法檢測，過表達VDAC1降低了擬南芥對寒冷脅迫的耐受性，而VDAC1突變株在冷脅迫下的表現優于野生植株，這表明VDAC1在冷脅迫反應中起負調控作用[124]。綜上分析，進一步說明線粒體介導植物細胞的程序性死亡。

6 結 語

大量研究證明，適量的ROS可以調控植物根、莖、葉及生殖細胞的增殖和分化，促進植物生長發育和器官形成。在植物面臨外部環境變化時，植物細胞被膜上的傳感器首先感知外部環境變化，并發出“警報”信號ROS，隨后這些“ROS”信號傳遞到細胞內部，最終到達細胞核，調節植物生長發育、形態結構、水分運輸、生理生化、氧化還原穩態、營養物質合成、植物內源激素變化以及基因表達調控等變化，最后實現植物的耐逆性(圖7b)。迄今為止，大量研究證實ROS產生于細胞內和細胞外，其中線粒體、葉綠體、NADPH氧化膜、過氧化物酶體等都是ROS的主要來源途徑。產生的ROS與Ca2+和電信號相互偶聯組成一種快速信號傳遞模式“ROS波”(波信號類似于“多米諾骨牌”效應[125]，最終激活“友鄰細胞”或遠端細胞的應激響應表達，雖然植物體內ROS成像技術對了解ROS的產生、信號傳導機制做出了重要的貢獻，但還有諸如以下很多問題依然需要進一步深入探索。

(1)各種產生ROS的細胞器或者酶之間是否存在信號交流機制，依然需要結合分子學和細胞學等理論方法進行更深一步的解析。令人欣喜的是，中國科學院遺傳與發育生物學研究所李家洋研究組證實了蘋果酸穿梭機制在葉綠體和線粒體間信號傳遞過程中起重要作用，產生的ROS最終誘導細胞的程序性死亡。該成果加強了我們對細胞器之間信號交流和植物PCD發生機制的認識[19]。同時，中國科學院分子植物科學卓越創新中心上海植物逆境生物學研究中心Rosa Lozano Duran課題團隊，研究發現了一條連接細胞膜和葉綠體的重要信號傳遞途徑，病原體可以劫持這種在植物細胞內部傳遞信息的途徑，抑制植物防御反應的激活[126]。這種新途徑的發現為設計植物的保護策略和開發新品種提供了新思路。孫萬倉課題組對甘藍型油菜油菜細胞超微結構觀察發現，大量的葉綠體主要圍繞在細胞膜附近區域(圖9)，同時葉綠體附件常伴有線粒體的出現[5]，這個證據也暗示甘藍型油菜油菜中也存在細胞膜、葉綠體和線粒體之間存在類似的信號傳遞途徑，最終將危險信號通過該途徑傳遞到細胞核，導致相關防御基因表達[127]。綜上分析，可以肯定的是各亞細胞單位或細胞器之間會發生物質(信息)的交流，從而使ROS 與其它信號分子協同形成一個或多個復雜的響應表達通路，從而使植物能夠積極、高效地應對各種生物和非生物脅迫[128]，但更多的信號交流機制仍需詳盡的解析。

(3)適量的ROS可與其它信號分子互作形成一個復雜的反應網絡，同時ROS可以修飾某些蛋白質或激活相關基因的表達，進而觸發信號轉導通路，使植物積極、高效地應對各種內在或外源的刺激信號以調控植物的生長發育。但ROS的異常積累會導致氧化miRNAs和蛋白之間的錯配，可能參與細胞程序性死亡的啟動，最終導致細胞死亡[129]。找到ROS作為信號分子參與植物響應脅迫(冷害、干旱等)應答的閾值水平范圍以及探索ROS與其它信號分子的互作、ROS與表觀遺傳修飾之間的相互作用，將對深入理解ROS信號網絡、表觀遺傳學和植物適應性和耐受性相互調節的機制具有重要意義[65]。