單生育期水分脅迫對溫室葡萄根際土壤酶活性及微生物群落的影響

高彥婷 ，黃 珍，張 芮，王 菲，董 博，楊昌鈺，李紅霞

(1.甘肅農業大學水利水電工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.陜西省土地工程建設集團，陜西 西安 710075；3.甘肅省農業科學院，甘肅 蘭州 730070)

土壤作為陸地生態系統的關鍵組分，在全球物質循環、能量轉化過程中扮演著重要角色[1-2]。土壤微生物是土壤養分轉化與腐殖質形成過程的重要參與者，在維持土壤生態功能中不可或缺[3]。土壤酶是土壤系統中最活躍的有機成分之一[4]，其反映土壤微生物的活性，代表土壤中物質代謝的旺盛程度，是評價土壤營養物質循環轉化以及各種農業措施和肥料施用效果的重要指標[5-6]。目前，土壤微生態調控已然成為土壤生態學研究的熱點[7-9]，且土壤微生物數量、土壤酶活性與土壤微生物群落結構組成等已作為土壤健康的生物指標來指導農田水肥管理[10-11]。

劉振香等[12]研究表明，施用有機肥可以顯著提高土壤微生物數量、多樣性及豐富度，提高微生物的生物量和代謝活性[13],但會降低細菌群落優勢度；過多施用有機肥并不能無限提高土壤微生物的豐富度和改善微生物的群落結構[14-15]。高彥波等[16]研究表明土壤酶活性與土壤肥力高度相關，磷酸酶與磷的相關性顯著[17],土壤碳氮可影響土壤酶活性[18]，較高的有機碳含量能促進土壤酶的合成[19-20]，在本底氮含量低的地區土壤酶活性與全氮表現為正響應[21-22]。李寶福等[23-25]研究表明由于根系分泌物和根際微生物積極活動的關系，植物根際的土壤酶促過程要比根際外強得多。Badiane等[26]利用土壤酶活性監測半干旱熱帶地區土壤質量，結果表明，植被、耕作方式及年限都會對土壤酶活性產生影響，但不同的酶對這些因素的響應不同。灌溉是農業生產中最主要的農業管理措施之一，具有促進作物生長和提高產量的作用，同時也對土壤微生物的數量、群落結構和活性產生影響[27]。研究表明，土壤水分的增加為各種酶促反應提供了反應條件與場所，酶活性隨土壤含水量的升高而增強[28-29]；但過多的土壤水分會增加Fe2+等還原性因子，進而影響土壤酶釋放，降低其活性[30]。綜上可知，以往研究多涉及土壤微生物、酶活性與肥料[12-15]、養分[16-22]、植物[23-26]、耕作方式等的相關性，雖然已有關于控水對農田土壤酶活性和微生物特征影響的研究[28-30]，但是關于控水對葡萄根際土壤的微生物群落結構和土壤酶的影響機制，尤其是水分管理對溫室葡萄根際土壤微生物群落結構的影響機理尚不清晰。西北地區是我國溫室栽培的優勢產區和農業水資源匱乏的地區，為此，研究充分供水和水分脅迫對溫室葡萄根際土壤微生物群落結構和土壤酶活性的影響，揭示控水對溫室葡萄根際土壤酶活性和微生物群落結構的影響機制，可為溫室葡萄科學用水管理提供一定理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗于2017年5—12月在甘肅省蘭州市永登縣設施栽培葡萄試驗基地進行，地理位置102°38′E，36°12′N，海拔2 005 m，地處干旱半干旱地區，屬大陸性氣候，年均氣溫5.9℃，降雨量290 mm，蒸發量4 640 mm。試驗區土壤主要為壤土，田間持水量27.2%(體積比)，容重1.42 g·cm-3，土壤pH值8.15，全氮0.82 mg·kg-1，堿解氮37.08 mg·kg-1，硝態氮108.36 mg·kg-1，銨態氮20.25 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

選用當地主栽葡萄‘紅地球’，晚熟歐亞品種，依據灌溉試驗規范將其生育期劃分為5個(見表1)。

表1 2017年葡萄生育期劃分表

葡萄種植于6 m×80 m的土墻草簾溫室大棚中，單臂Y型矮單籬架栽培方式，行距2.0 m，株距0.8 m。采用單因素完全隨機試驗，在全生育期以土壤含水率下限為田間持水率θf的75%為充分供水對照(CK)，每個生育期設定土壤含水率下限依次為45%θf的重度水分脅迫處理(S)和60%θf的輕度水分脅迫處理(M)，3次重復，共計33個小區，各小區面積均為12 m2(2 m×6 m)。具體設計如表2。

表2 試驗處理

采用1管1行滴灌控制系統，于各小區同側鋪設滴灌帶，灌水由各分支前的閥門控制。灌水時間由各處理實測土壤含水率確定，當試驗地實測土壤含水率(0～100 cm平均值)占田間持水率百分比達到表2中設計下限值時灌水，灌水定額均為270 m3·hm-2，灌水后充分供水(CK)土壤含水率達到田間持水率，輕度S和重度M脅迫處理分別達到85%θf和75%θf，非脅迫生育期灌水后土壤含水率上限與CK組相同，即都達到田間持水率。在標準試驗地之間鋪設1 m深2 mm厚的聚乙烯土工膜以防止土壤水擴散。所有試驗地施肥、修剪、病蟲害防治及除草等農藝措施均與當地溫室葡萄栽培管理相同。

1.3 土壤樣本采集與處理

1.3.1 土壤含水率的測定 在各試驗小區沿葡萄行方向距端點2、4 m位置，離主干橫向20～30 cm同側位置選取2個測點，在各點縱深分別為10、20、40、60、80、100 cm處取土樣，用烘干法測定相應深度處土壤含水率，取樣點含水率取各縱深點的算術平均值，小區含水率取兩個點平均值。全生育期每10 d取樣一次，灌水前后土壤含水率接近灌水控制下限值(表2)時加測。

1.3.2 土壤細菌群落多樣性、微生物生物量碳及土壤酶活性的測定 各處理同側距端點1、3、5 m處，去除土壤表層雜物，在靠近根系處用直徑2 cm土鉆鉆取深度20 cm左右處土壤樣本，同處理三測點土樣混勻后，去除可見根，裝入無菌密封樣本袋中，用冰盒盡快帶回實驗室，過2 mm篩低溫(-20℃)保存，用于土壤細菌群落多樣性、微生物生物量碳及土壤酶活性的測定。

土壤細菌群落多樣性委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司通過高通量16S rDNA擴增子測序處理；微生物生物量碳采用氯仿熏蒸浸提法[31]；土壤酶(蔗糖酶、淀粉酶)活性均采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定[32]。

1.4 數據處理

采用Excel 2007和SPSS 21.0數據分析軟件進行統計分析和作圖，并用鄧肯(Duncan)法進行多重比較檢驗。

2 結果與分析

2.1 單生育期水分脅迫對葡萄根際土壤酶活性的影響

從圖1可以看出，全生育期內CK處理土壤蔗糖酶活性呈“M”型變化、淀粉酶活性呈倒“V”型變化，且均在果實膨大期達到最高水平(分別為5.41 mg·g-1·d-1和2.35 mg·g-1·d-1)。

由單生育期水分脅迫下土壤蔗糖酶活性的單因素方差分析可知(圖1A)，萌芽期GS、GM處理較對照CK分別高66.7%和73.2%，但所有處理間均無顯著性差異。新梢生長期，PM較CK略有提升，差異不顯著，但兩者均顯著高于PS，其他處理間均不存在顯著性差異。開花期，處理FS、FM均較CK略高，但無顯著性差異，GS、PS顯著高于CK。果實膨大期，各處理的土壤蔗糖酶活性均達最大值，其中EM處理顯著高于CK，而ES處理較CK無顯著性差異，卻顯著低于EM，說明果實膨大期的輕度水分脅迫也能夠顯著提高土壤中蔗糖酶活性。著色成熟期，處理CS、GS均低于CK，但不存在顯著性差異，而GM處于最高水平，顯著高于CS和CM，但與CK間無顯著差異。這可能由于該時期在葡萄生育期中歷時最長(91 d)，長時間水分脅迫抑制了土壤中蔗糖酶活性，而GM處理在葡萄生長早期抑制了葡萄的營養生長，促進葡萄根的生長，復水后的補償效應使得后期生長中土壤微生物活動增強，表現為土壤蔗糖酶活性增強。

土壤淀粉酶活性在單生育期水分脅迫條件下也存在明顯變化(圖1B)。萌芽期GS處理較CK減小19.7%，二者間無顯著性差異，但均顯著低于GM；新梢生長期PM有所提升，PS有所下降，但與CK均無顯著性差異，而PM顯著高于PS；開花期FS在各處理間處于最低水平，FM比CK高出13.5%，但與CK均無顯著性差異，PM在各處理間處于最高水平，顯著高于FS，但與CK間不存在顯著差異，可能因為新梢生長期受輕度脅迫導致的水分虧缺在開花期迅速得以補充，使得土壤淀粉酶活性增強，而PS表現不明顯，分析可能是新梢生長期重度水分脅迫抑制了根的生長，即使開花期恢復灌溉仍不能使土壤淀粉酶活性得到恢復。果實膨大期，除ES外，各處理淀粉酶活性均達到整個生育期的最大值，表現為PM>FM>EM>PS>CS>FS>CM>GM>CK>GS>ES，ES顯著低于PM和FM，但與CK差異不顯著。 著色成熟期后，隨著氣溫的降低微生物活動強度減弱，土壤淀粉酶活性普遍降低；處理CS、CM較CK分別降低了54.0%和22.3%，但均無顯著性差異。

2.2單生育期水分脅迫對葡萄根際土壤微生物生物量碳的影響

表3表明，充分供水處理CK土壤微生物量碳在全生育期內經歷了從萌芽期到開花期快速增大、生育期后期(果實膨大期和著色成熟期)緩慢減小的過程，且開花期積累達到最大值(242.48 mg·kg-1)。

表3 單生育期水分脅迫對根際土壤微生物生物量碳的影響/(mg·kg-1)

萌芽期GS處理下的土壤微生物量碳顯著小于CK,降低了43.0% ，GM較CK增加了2.7%，但無顯著性差異；新梢生長期PS處理土壤微生物量碳明顯降低，且顯著低于CK及其他處理，PM土壤微生物量碳雖較CK降低2.4%，但二者間無顯著性差異；除處理FS和EM外，開花期各處理的土壤微生物量碳都達到了全生育期的最大值，FS較CK降低29.2%，且與CK和GS有顯著性差異；果實膨大期ES處理的土壤微生物量碳較CK降低28.7%，且二者間存在顯著性差異，EM處理較CK降低4.5%，二者間無顯著性差異；著色成熟期處理CS較CK降低10.8%，但二者間不存在顯著性差異，處理CM的土壤微生物量碳高于CK；ES處理的土壤微生物量碳在這一時期恢復灌溉后迅速提升，但與CK無顯著差異，而處理GS及PS分別比CK高出13.4%和15.6%，差異達到顯著性水平。說明著色成熟期水分脅迫處理對土壤微生物量碳的影響較充分供水處理不明顯；而萌芽期和新梢生長期的重度水分脅迫在恢復灌溉后對生育期末期微生物量碳的積累有利。

2.3 水分脅迫對葡萄根際土壤微生物α-多樣性的影響

菌群豐度指數Chao1和菌群多樣性指數Shannon與群落多樣性呈正比，測序深度指數Coverage越高說明樣本中序列被檢出的概率越高。選取溫室栽培葡萄開花期、果實膨大期和著色成熟期CK、GS、PS、FS、ES、CS 處理根際土壤進行高通量測序，研究單生育期水分脅迫條件下根際細菌群落結構和物種多樣性的變化情況。表4中樣本覆蓋率在0.966～0.982間，說明根際土壤樣本微生物測序結果獲得了絕大多數樣本信息，能夠反映樣本代表的根際土壤中微生物的真實情況。

表4 不同生長期根際土壤微生物群落α-多樣性

由表4可以看出，不同生育期重度水分脅迫對葡萄根際土壤微生物群落的豐富度和多樣性均有影響。開花期FS的Chao1、ACE和Shannon及OTUs指數均顯著高于CK，同時也高于處理PS和CS。果實膨大期，處理ES的Shannon指數較對照CK降低1.7%，差異不顯著；處理FS的指數Chao1和ACE、Shannon及OTUs依然顯著高于對照CK。著色成熟期處理CS的指數Chao1、ACE和OTUs均小于對照CK，但差異不顯著；處理ES的Shannon指數顯著小于對照CK，指數Chao1、ACE和OTUs均大于對照CK，但差異不顯著。

2.4 門水平上根際土壤細菌群落組成及結構

2.4.1 葡萄根際土壤細菌相似度聚類分析 基于 weighted UniFrac距離的層次聚類分析( 圖2)結果顯示，不同生育期水分脅迫條件下葡萄根際土壤菌群結構差異明顯。開花期(圖2A)，處理FS和CK距離最近，ES、GS和PS可聚為一類，CS和CK距離最遠；果實膨大期(圖2B)，處理PS和CK距離最近，FS、CS和ES可聚為一類，GS和CK距離最遠；著色成熟期(圖2C)，處理GS和CK距離最近，PS和CK趨同性最差。

2.4.2 葡萄根際土壤細菌群落組成分析 對門水平上各脅迫處理樣本中相對豐度排名前十的菌落分組物種(其余豐度相對較低的歸為Others)與CK樣本進行相關性分析并繪制其相對豐度圖(圖2)。門水平上微生物豐度排名前十的物種在單生育期水分脅迫下差異明顯，但變形菌門(Proteobacteria)始終是優勢類群，占比為36.04%～54.58%(平均41.06%)。

開花期(圖2A)，各菌門占比遞減次序為：厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、

擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、浮霉菌門(Planctomycetes)、熱微菌門(Thermomicrobia)，平均占比分別為：13.49%、13.09%、5.42%、6.2%、4.68%、3.78%、2.89%、2.47%、1.76%。其中，CS處理的變形菌門(Proteobacteria)占比最低，與占比最高的CK處理差異顯著，說明開花期水分脅迫對變形菌門(Proteobacteria)有抑制作用；處理FS的變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)相對占比較處理CK分別降低了0.4%和4.67%，但差異不顯著；處理ES和CS的浮霉菌門(Planctomycetes)相對占比顯著高于其占比最小的CK處理，說明水分脅迫有利于浮霉菌門(Planctomycetes)的生長。排名前十其他門細菌群落的相對占比與CK處理不存在顯著性差異。

果實膨大期(圖2b)，各菌門占比遞減次序為：放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、螺旋體門(Spirochaetes)，平均占比分別為：9.86%、8.74%、8.56%、6.41%、3.82%、3.39%、2.67%、1.60%、1.42%。其中，ES處理的放線菌門(Actinobacteria)相對占比最高(12.22%)且顯著高于CK，說明果實膨大期水分脅迫有助于放線菌門(Actinobacteria)的繁殖，其酸桿菌門(Acidobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)的相對占比分別高出CK的1.6%和1.35%，差異顯著。TOP10其他門細菌群落的相對占比與CK處理差異不顯著。

著色成熟期(圖2c)，各菌門占比遞減次序為：芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)，平均占比分別為：9.36%、8.10%、6.88%、6.54%、4.27%、4.27%、4.00%、3.27%、3.27%。其中，CS的變形菌門(Proteobacteria)較CK提高3.63%，擬桿菌門(Bacteroidetes)降低0.76%，綠彎菌門(Chloroflexi)降低0.62%，說明著色成熟期水分脅迫有利于變形菌門(Proteobacteria)的生長，會抑制放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)的繁殖，但均無顯著性差異；其放線菌門(Actinobacteria)豐度最低，廣古菌門(Euryarchaeota)最高，且均與其他處理差異顯著。TOP10其他門細菌群落的相對占比與CK處理差異不顯著。

2.5 溫室葡萄根際土壤環境因子在門分類水平上的相關性分析

采用斯皮爾曼(Spearman)相關分析法對不同生育期葡萄根際土壤環境因子(土壤水分、土壤淀粉酶活性、土壤蔗糖酶活性、土壤微生物生物量碳)在根際土壤細菌門分類水平上的相關性進行研究表明，不同生育期水分脅迫下葡萄根際土壤環境因子對細菌門分類水平上的影響不同(圖3)。土壤含水率只在開花期與溫室葡萄根際土壤豐度排名TOP10的細菌中變形菌門(Proteobacteria)呈顯著正相關(相關系數為0.5026)，與放線菌門(Actinobacteria)呈顯著負相關(相關系數為-0.5253)(圖3A)，在果實膨大期和著色成熟期與細菌各門類相對豐度相關性不顯著(圖3B、C)；土壤淀粉酶在果實膨大期與根際土壤中擬桿菌門(Bacteroidetes)呈顯著正相關(相關系數為0.5191)，與奇古菌門(Thaumarchaeota)呈極顯著負相關(相關系數為 -0.6078)(圖3B)，在開花期和著色成熟期與細菌各門類相對豐度相關性不顯著(圖3A、C)；土壤蔗糖酶在果實膨大期與根際土壤中浮霉菌門(Planctomycetes)和放線菌門(Actinobacteria)分別呈顯著和極顯著正相關(相關系數分別為0.5108和0.6615)(圖3B)，在著色成熟期與廣古菌門(Euryarchaeota)和厚壁菌門(Firmicutes)分別呈顯著和極顯著負相關(相關系數分別為-0.5248和-0.6017)(圖3C)，在開花期與細菌各門類相對豐度相關性不顯著(圖3A)；土壤微生物量碳在開花期與放線菌門(Actinobacteria)呈極顯著負相關(相關系數為-0.6285)(圖3A)，在果實膨大期與浮霉菌門(Planctomycetes)、奇古菌門(Thaumarchaeota)呈顯著正相關(相關系數分別為0.5294和0.4799)，與放線菌門(Actinobacteria)呈極顯著正相關(相關系數為0.6347)，與變形菌門(Proteobacteria)呈極顯著負相關(相關系數為-0.6017)(圖3B)，在著色成熟期與細菌各門類相對豐度相關性不顯著(圖3C)。

3 討 論

不同類型的土壤酶活性隨生育期的變化不盡相同[33]。本研究中溫室葡萄全生育期內，CK處理土壤蔗糖酶活性呈“M”型變化、淀粉酶呈拋物線型變化趨勢，且均在果實膨大期達到最高水平。水分作為影響農作物生長的重要環境因子，對土壤酶活性有至關重要的作用。田幼華等[34]研究表明，土壤酶活性隨土壤水分的增加而增加。萬忠梅等[35]認為，在干濕交替和較干旱條件下土壤酶活性高于長期處于淹水條件，同時隨著土壤含水量的增加酶活性逐漸降低。本研究中各生育期M處理(輕度水分脅迫)的土壤蔗糖酶和淀粉酶活性均高于S處理(重度水分脅迫)和除著色成熟期外的CK對照，這與周芙蓉等[36]一定程度水分脅迫能提高土壤酶活性的結論一致。著色成熟期土壤蔗糖酶和淀粉酶活性普遍降低，可能由于氣溫的降低導致微生物活動強度減弱，進而影響了酶活性，也可能是因為該期時間較長，長時間水分脅迫抑制了土壤酶活性。土壤酶活性與土壤微生物量較其他土壤性質更迅速地響應控水管理[37]，著色成熟期水分脅迫對土壤微生物量碳的影響與充分供水差異不顯著；而萌芽期和新梢生長期的重度水分脅迫在恢復灌溉后對生育期末期微生物量碳的積累有利。

土壤微生物類群在土壤生態系統中有著非常重要的作用，其數量特征可表征土壤質量好壞及肥力的高低[38-40]。試驗中微生物群落豐富度指數(Chao1和ACE)、香農指數(Shannon)及OTUs在各處理基本表現為：開花期最大，膨大期減小，著色成熟期有所回升，且在處理FS中增大明顯。說明開花期重度水分脅迫處理能夠增加同期土壤微生物群落多樣性，因為開花期適宜的溫度和濕度為微生物提供了良好的環境，有助于微生物生長繁殖；膨大期重度水分脅迫對同期微生物群落多樣性影響不明顯，但能夠增加其著色成熟期微生物群落多樣性，分析原因可能是隨著季節變化低氣溫抑制了微生物的生長，使得微生物數量在果實膨大期有所下降；著色成熟期大量植物腐爛后使得土壤中有機質增加，有助于微生物生長，故在該期微生物數量和多樣性有所回升，這與李杰[41]、趙萌[42]等得出微生物數量和多樣性受季節變化影響顯著的結論一致。

研究發現不同生育期水分脅迫對設施葡萄根際土壤微生物在門分類水平上相對豐度影響程度不同，根際土壤優勢類群為變形菌門(Proteobacteria)，其他優勢種群包括放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)等，這與王曉雯等[43]對葡萄園土壤細菌群落結構的研究結果類似。相關性分析表明，土壤含水率在開花期與變形菌門呈顯著正相關，與放線菌門呈顯著負相關，在果實膨大期和著色成熟期與細菌各門類相對豐度相關性不顯著，即開花期土壤水分是影響根際土壤變形菌門和放線菌門相對豐度的主要因素。農田土壤微生物多樣性包含物種、結構、遺傳和功能等多樣性，針對多年生藤本植物葡萄，本研究僅就一個年度內的控水對溫室葡萄根際土壤微生物物種多樣性進行了分析，后期應結合其他多樣性方面的檢測，就連續多年水分調虧對溫室葡萄根際土壤生態環境的影響做更深入的研究。

4 結 論

1)溫室葡萄根際土壤酶活性、微生物量碳均隨季節變化，水分脅迫對溫室葡萄根際土壤酶活性有不同程度的影響，且在各個生育期恢復灌溉后，會對脅迫造成的土壤酶活性及微生物量碳的降低有不同程度的補償，土壤蔗糖酶活性對土壤水分變化較淀粉酶更為敏感。

2)水分脅迫的持續時間對溫室葡萄微生物群落結構多樣性和豐富度影響較大，短期水分脅迫(如開花期)對其有提高作用，長時間尤其重度脅迫(如果實膨大期)對微生物群落結構多樣性抑制作用顯著，且水分脅迫對微生物群落結構積極或不利的影響都具有一定的滯后性和延續性。

3)不同處理對溫室葡萄根際土壤門分類水平上相對豐度有不同程度影響，并且同一處理在各生育期內不同門分類細菌變化情況不同，溫室葡萄根際土壤中門分類水平上細菌優勢類菌群為變形菌門(Proteobacteria)。

4)在不同生育期，影響根際土壤細菌相對豐度的主要因素不同。開花期，土壤水分、土壤微生物生物量碳是影響根際土壤變形菌門和放線菌門相對豐度的主要原因；果實膨大期，土壤淀粉酶、蔗糖酶活性及土壤微生物生物量碳是影響土壤細菌相對豐度的主要因素；著色成熟期，蔗糖酶活性為影響根際土壤細菌相對豐度的主要因素。