油菜苗期抗旱性鑒定及抗旱指標評價

黃 倩，趙永國，徐勁松，曾 柳，呂 艷，程 勇，張學昆，陸光遠

(1.廣東石油化工學院，廣東 茂名 525000; 2.中國農業科學院油料作物研究所，湖北 武漢 430062;3. 浙江大學作物科學研究所/農業農村部光譜檢測重點實驗室，浙江 杭州 310058;4. 長江大學/濕地生態與農業利用教育部工程研究中心, 湖北 荊州 434023)

油菜是我國最重要的冬季油料作物，菜籽油占國產植物食用油的50%[1]。我國油菜年均種植面積700萬hm2左右，其中80%分布在長江流域[2]。隨著全球氣候變暖，季節性干旱頻繁發生，嚴重威脅到油菜的生產安全。春季干旱正處于油菜生殖生長的關鍵時期，可顯著降低油菜產量，嚴重時甚至絕產[3]。秋季干旱對油菜種子萌發和苗期產生嚴重影響，比如，2010年我國發生的秋季干旱持續時間長達70～112 d，黃淮流域和長江中游偏北地區約86.7萬hm2油菜受到嚴重影響，受災地區油菜單產下降15.5%以上，總產減產達25%～32%[4-5]。因此，開展油菜抗旱育種研究、減少干旱脅迫對油菜生產的危害、保證油菜穩產高產是當前油菜產業需要解決的重要問題。開展抗旱材料的評價、篩選及鑒定則是油菜抗旱育種的前提條件。

作物的抗旱性受多種基因控制，是一個復雜的數量性狀，很難直接評估。通常多采用抗旱系數、抗旱指數等指標評估品種抗旱性，這些評價指標已經在油菜、棉花、高粱等作物抗旱研究中得到成功運用[6-8]。朱宗河等[9]利用主成分分析、隸屬函數分析以及聚類分析對甘藍型油菜的抗旱性進行了鑒定和評價。謝小玉等[10]運用聚類分析和灰色關聯度分析發現葉片相對含水量、丙二醛、葉面積可作為油菜抗旱種質篩選的依據。陳嬌[11]等通過關聯度分析發現光合參數指標、含水量指標、植株形態和根系性狀指標與油菜苗期的抗旱性關系密切。左凱峰等[12]發現可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛和離體葉片保水力等性狀可作為甘藍型油菜抗旱性苗期鑒定的指標。上述研究通常采用多個生理指標在室內綜合鑒定油菜抗旱性，然而其抗旱性鑒定結果的有效性需要其他試驗進一步證實，迄今鮮見將室內綜合抗旱指標與苗期干旱存活率進行對比的研究，以驗證利用綜合指標鑒定品種抗旱性的準確性。本研究在前人研究的基礎上，利用PEG 6000模擬苗期干旱脅迫，通過對79份油菜材料12個指標的抗旱性的綜合評價，分析比較了綜合指標與苗期干旱存活率的關系，驗證抗旱指標的準確性，同時對各抗旱生理生化指標進行評價，確定了油菜抗旱性鑒定的合適指標，篩選獲得一批抗旱材料，為油菜抗旱育種提供理論和材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

使用的油菜材料共79份，其中包括來源于歐洲及日本的44個冬性和14個春性甘藍型油菜品種，以及來自中國的5個半冬性甘藍型油菜品種。此外，為了擴大篩選范圍，試驗材料還包括4份羽衣甘藍、6份瑞典甘藍，以及6份飼料油菜(表1)。

表1 本試驗用到的油菜材料

1.2 試驗設計與處理

每個品種選擇大小一致、顆粒飽滿的種子先浸泡于濃度為3%的 NaClO溶液中消毒10 min，然后用蒸餾水沖洗凈種子，將其移至浸濕1/4濃度的Hoagland[13]營養液的紗布上發芽。待發芽7 d后，挑選長勢一致的苗子用方形海綿包裹，移栽到打有孔(孔徑d=2 cm)的塑料板中，并將塑料板移至裝有8 L營養液(1/2濃度的Hoagland營養液)的深色盒子(34 cm×26 cm×13 cm)內。在恒溫生長間內培養，控制光周期時間為16 h/8 h(光照/黑暗)，晝夜溫度25℃/18℃，光照強度為300 μmol·m-2·s-1，相對濕度60%～70%。待油菜長至2～3片真葉時轉移到含有全濃度營養液(對照CK)和含有2.5% PEG 6000 (m/v)的營養液中(處理組S)培養3 d，然后將處理組PEG 6000濃度提高到5% (m/v) 繼續培養3 d。該試驗采用隨機區組設計，每個處理設置4次重復。

1.3 生理指標的測定

在干旱脅迫處理期間，每天中午13∶00利用手持紅外測溫儀(Testo 845，德國)定時測定同一葉片

的葉面溫度變化，同時每隔1 d利用手持式葉綠素儀(Konica Minolta SPAD-502，日本)測定該葉片的SPAD值。處理6 d后測定葉面積[14]、葉片相對含水量、地上和地下部鮮重，隨后于105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重后稱取干重。同時取葉片用液氮速凍后保存于-80℃；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和游離脯氨酸(Pro)含量均使用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，具體方法參考產品說明書進行。葉片相對含水量公式如下[15]：

相對含水量(%)=(W0-W1)/(W2-W1)×100

式中，W0為葉片鮮重，W1為葉片干重，W2為葉片飽和重量(在黑暗的條件下，葉片浸泡在雙蒸水中24 h后稱重)。

1.4 油菜苗期干旱存活率試驗

參考景蕊蓮的方法[16]，試驗材料種于35 cm×20 cm×10 cm的藍色塑料盒中。盒中裝有過篩后的大田耕土，土層厚8 cm，每個材料20株，每盒8個品種，且每盒都有一個相同的對照品種，試驗重復3次。當幼苗長至3葉期時停止澆水，開始自然干旱。每天定時利用快速土壤水分測定儀(TZS-1W型，浙江拓普頓儀器有限公司)測定每盒土壤含水量，當土壤含水量降至5%左右時，進行復水，3 d后觀察幼苗存活情況，以芯葉轉綠為標準計算每份材料的干旱存活率。

1.5 指標計算

參考陳嬌等[11]方法計算抗旱系數DRC(drought resistance coefficient)、隸屬函數、抗旱性度量數。計算公式如下：

各指標抗旱系數:DRC=S/C

隸屬函數：

抗旱性度量數：

式中，S為干旱條件下各指標的測定值；C為對照條件下各指標的測定值；P為各品種各性狀的抗旱系數；Pmin和Pmax為各測定性狀抗旱系數的最小值和最大值；Xij為第i品種的第j性狀；n為性狀數；m為品種數。

1.6 數據統計分析

利用Microsoft Excel對數據進行初步整理，采用DPS 14.5軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下油菜苗期各性狀的變化

表2是79份甘藍型油菜苗期性狀的表型分析結果。由表1可以看出，油菜各性狀在正常和干旱條件下均呈現顯著的差異。與正常供水(CK)相比，干旱脅迫條件下各項測定指標均呈現明顯變化。其中，地上鮮重下降最大，降幅平均達到69.5%；葉面積也顯著下降，平均降低了57.9%。這表明在干旱脅迫下植株嚴重缺水，影響植株正常生長；嚴重干旱時葉片甚至邊緣蜷縮、干枯，植株鮮重顯著下降。此外，相較正常水分條件下，干旱脅迫下地上干重、地下鮮重、地下干重均顯著下降，降幅分別為33.3%、23.9%和25%(表2)。相較于地上部重量，地下重量降低的幅度較小。這可能是由于油菜在遭受干旱脅迫時，為了抵御干旱脅迫，減少細胞間的滲透壓，加速根的生長進而促進水分的吸收。各品種在干旱脅迫條件下抗氧化保護酶活性和脯氨酸含量都顯著升高，且脯氨酸含量相較于對照呈幾十倍的增加。干旱脅迫后CAT含量平均增加了7.6%，POD含量平均增加了67.2%，SOD含量平均增加了1.2%，脯氨酸含量平均增加了294%。我們還分析比較了上述10個指標在79份油菜資源中的分布規律及遺傳差異，結果表明大多性狀的抗旱系數總體頻次變異表現為近似正態分布(圖1)。

表2 PEG6000模擬干旱脅迫對油菜苗期性狀的影響

2.2 油菜苗期抗旱性鑒定指標的篩選

將正常和干旱條件下油菜苗期各性狀進行了相關性分析，結果見表3。表中對角線的數據是各性狀在正常和干旱條件下兩者之間的相關性，所有性狀在不同水分條件下的測定值均具有較高的相關性。其中，在干旱和正常水分條件下SOD、CAT和POD的相關系數分別為0.626、0.626和0.641，達到極顯著水平。地上干重、地下鮮重以及葉面積的相關性也達到極顯著水平，相關系數分別為0.838、0.830和0.674，表明在正常條件下表現較好的材料在脅迫條件下也很可能表現較好。另外，在正常水分條件下各指標之間也具有一定的相關性。比如，POD和CAT極顯著正相關，相關系數為0.633**，脯氨酸和SOD的相關系數為0.314**；在干旱脅迫下這些相關性仍然達到顯著水平(表3)。葉面積與相對含水量在正常水分條件下顯著正相關(r=0.249*)，但在干旱脅迫下相關不顯著。同時，分析發現地上鮮重、地上干重、地下鮮重和地下干重之間無論是在正常條件還是干旱脅迫下均顯著正相關，表明這些指標之間包含有重疊信息，可以精簡指標或者通過統計處理后形成新的指標來進行抗旱性鑒定評價。

表3 正常水分和干旱條件下油菜苗期各指標的相關性分析

對各指標的抗旱系數做進一步的相關性分析(表4)，可以看出，葉面積與相對含水量、地上鮮重、地上干重、地下干重和地下干重的抗旱系數均呈顯著正相關，相關系數分別為0.238*、0.513**、0.554**、0.540**和0.525**。相對含水量與地上鮮重和地上干重的抗旱系數均顯著正相關，相關系數分別為0.47**和0.372**。另外，地上鮮重、地下鮮重、地上干重和地下干重4個性狀的抗旱系數之間呈現顯著正相關，因為這些性狀本身就具有較高的相關性。然而，抗氧化保護酶(SOD、CAT和POD)的抗旱系數之間的相關性較低；盡管脯氨酸含量與POD抗旱系數的相關性達到顯著水平，但相關系數仍然較小(0.258)。

為了進一步確認各指標的可靠性并找到最佳的抗旱鑒定指標，我們利用各性狀的抗旱系數計算了各指標的隸屬函數，再計算各品種的抗旱性度量值D，將各性狀的抗旱系數與抗旱性度量值D進行相關性分析。如表4所示，大部分指標的抗旱系數與D值呈顯著正相關。其中，脯氨酸抗旱系數的相關系數最大(0.745**)。按照相關系數的大小進行排序，其它性狀依次為：POD活性>地下干重>地下鮮重>地上鮮重>CAT活性>地上干重>LRWC。另外，葉面積和SOD的抗旱系數均與D值相關不顯著。以上結果表明，葉片相對含水量、地上鮮重、地上干重、地下鮮重、地下干重、CAT、POD和脯氨酸含量均可以作為鑒定油菜苗期抗旱性的輔助指標。

表4 油菜苗期各性狀的抗旱系數(DRC)與其抗旱度量數D值的相關系數矩陣

2.3 油菜苗期抗旱性品種的篩選

干旱脅迫后將各性狀的抗旱系數利用公式計算相對應的隸屬函數值，再計算各品種所有性狀的抗旱性度量值D，綜合比較各品種抗旱性。如表5所示，將79份材料的D值做了排序，D值越高，表明品種的抗旱性越好，以0.5作為閾值，將D值大于0.5的品種劃分為抗旱品種，將D值小于0.3的品種劃分為干旱敏感品種，將D值介于兩者之間的劃分為中度抗旱品種。由表5可知，79份材料根據D值可以劃分為39個干旱敏感品種、8個抗旱品種、32個中度抗旱品種。

表5 79份油菜苗期抗旱性D值

2.4 干旱脅迫下不同基因型油菜的葉片溫度和SPAD值變化

利用兩個抗旱品種(編號為T-57和T-9)和兩個干旱敏感品種(S-7和S-41)比較不同脅迫程度下各葉片溫度抗旱系數的變化。由圖2A可以看出，4個品種基于葉片溫度的抗旱系數整體上呈上升趨勢。經過1 d濃度為2.5%的PEG 6000適應性處理后，各品種的葉面溫度都明顯下降。這可能是由于植物在遭遇干旱時，氣孔擴大、蒸騰作用加快、葉片表面的熱量被水分帶走，從而促使葉片溫度下降。隨著處理時間的延長以及干旱脅迫程度的遞增，各品種的葉面溫度逐漸上升，其中抗旱品種上升幅度要大于干旱敏感品種。這可能是因為抗旱品種在遭遇干旱時，為了抵御干旱脅迫，減少氣孔開幅，減少蒸騰速率，進而葉片表面溫度上升更快。在干旱脅迫處理前，抗旱品種的溫度高于敏感品種；經過6 d的干旱脅迫，抗旱品種的葉面溫度仍然高于干旱敏感品種，似乎表明葉面溫度也可以間接反映出油菜材料抗旱性差異。

4個品種基于葉片SPAD值的抗旱系數的變化規律與葉面溫度抗旱系數相似(圖2B)。隨著脅迫時間的延長、PEG 6000處理濃度的遞增，4個品種的葉片SPAD值都呈顯著的上升趨勢。經過1d 5%濃度的PEG6000處理后其上升趨勢明顯加大。直接觀察葉片會看到葉片顏色逐漸加深，甚至有的出現深綠色。比較干旱品種和敏感品種發現，干旱品種SPAD值抗旱系數上升幅度要大于干旱敏感品種。

其中，抗旱品種T-57 SPAD值上升了53.1%，敏感品種S-41 SPAD值上升了31.7%。這可能是由于抗旱品種為了抵御干旱，通過增加葉片中葉綠素含量，提高光合作用速率，來維持油菜的生長和發育。

2.5 油菜苗期干旱存活率試驗

對79份材料進行苗期干旱存活率試驗，在土壤水分含量低于5%時復水，測定各品種的存活率，進而比較各品種之間的抗旱性差異。干旱脅迫條件下，將部分抗旱品種和部分干旱敏感品種的干旱存活率列于表6,干旱存活率越高的品種其抗旱性越好。由表6可以看出，抗旱品種T3、T57、T17、T9、T25、T71的平均干旱存活率分別為96%、61%、95%、88%、67%和85%，而干旱敏感品種的干旱存活率均低于30%。同時，干旱存活率與抗旱度量D值之間的回歸分析表明兩者之間具有顯著的線性關系(圖3)，線性回歸方程的決定系數達到0.53(P<0.01)，表明干旱存活率也是評價油菜苗期抗旱性的良好指標。

表6 不同抗旱型油菜苗期干旱存活率/%

3 討論與結論

作物的抗旱性是一個十分復雜的生理過程，干旱發生時，往往是多個性狀同時發生復雜的變化。苗期是油菜生長的關鍵時期，此時鑒定油菜抗旱性具有時間短、重復性強、易于操作等優點。近年來，多個指標的綜合評價在小麥[17]、甘薯[18]、芝麻[19]、苦蕎[20]等作物抗旱鑒定中已普遍使用，可有效避免單一指標的片面性，成功篩選出耐旱優異種質。徐銀萍等[21]研究發現抗旱度量值D與產量密切相關，以D值為評價指標能有效且客觀地評價品種間的抗旱性差異。本研究利用抗旱系數法、隸屬函數法得到抗旱性量度值(D值)。利用D值可以較為準確地衡量各指標的權重性與指標間的相互關系[19]。本研究以抗旱度量值D值為指標，將79份甘藍型油菜材料劃分為三個抗旱等級。

有關油菜抗旱指標的篩選，前人做了大量研究工作。白鵬等[22]對干旱脅迫下油菜蕾薹期的生理特征研究發現，SOD、POD、CAT、株高、水分利用率等性狀可作為油菜蕾薹期抗旱鑒定的主要指標。Munns等[23]研究發現葉面溫度與蒸騰強度顯著負相關，因此可以利用葉面溫度的變化來間接表示葉片氣孔蒸騰速率的變化。本研究中，我們對不同干旱脅迫程度下葉面溫度和葉片SPAD值做了分析，發現隨著干旱脅迫時間的延長以及干旱脅迫強度的遞增，抗旱品種和敏感品種的葉片SPAD值都呈顯著的上升趨勢。此外，隨著處理時間的延長、處理濃度的遞增，各品種的葉面溫度先下降再逐漸上升，其中抗旱品種上升幅度要大于干旱敏感品種。本研究通過比較不同脅迫條件下各品種葉片溫度的變化，發現抗旱性顯著不同的4個油菜品種在脅迫初期抗旱品種和干旱敏感品種的葉面溫度都顯著上升；隨著脅迫時間的延長，葉面溫度上升幅度減小，抗旱品種葉面溫度上升幅度高于敏感品種。這是由于植物在遭遇干旱時，為了減少葉面蒸騰消耗，氣孔較早關閉或減少氣孔開口幅度，防止葉片可能發生的水分虧缺和水勢下降，進一步保證了光合作用的進行[24]。洪雙等[25]采用反復干旱的處理方法，發現地上部鮮重抗旱指數、植株總鮮重抗旱指數和旱害指數3個指標可作為苗期抗旱性鑒定的有效評價指標。

然而，前人研究多側重于單一綜合評價指標，缺乏多種評價方式相結合，鮮見將綜合抗旱指標與苗期干旱存活率進行比對分析，以驗證各綜合抗旱指標預測品種抗旱性的準確性。在本研究中，相關性分析表明各指標的抗旱系數與D值緊密相關，其中地上鮮重、地上干重、地下鮮重、地下干重、POD和脯氨酸的抗旱系數均與D值呈極顯著正相關。此外，D值還與CAT、地下干重、相對含水量的抗旱系數均顯著正相關。進一步的回歸分析表明，苗期干旱存活率與抗旱性度量值D之間存在顯著的線性關系，說明干旱存活率也可以作為抗旱性快速評價的良好指標。綜上，在油菜苗期抗旱性鑒定中，有針對性地測定與D值密切相關的指標，如地上鮮重、地上干重、地下鮮重、地下干重、POD和脯氨酸可有效鑒定油菜種質資源的抗旱性，篩選獲得極端抗旱材料。

另外，在油菜苗期相對含水量、地上鮮重、地上干重、地下鮮重、地下干重、CAT、POD和脯氨酸均可以作為油菜苗期抗旱性鑒定的輔助指標。