種植體周圍組織不同健康狀況下齦溝液微生物特性分析*

徐 雯 鄂玲玲 張 戎 王俊成 劉 琳 史連瑞 王瀟宇 李鴻波

目前，口腔種植技術(shù)已成為修復(fù)缺失天然牙的主要治療方式。有研究表明，牙種植體的長(zhǎng)期存留率高達(dá)95%-99%[1]。隨著種植修復(fù)的廣泛使用，種植體周圍病的發(fā)生也在增加。Derks等[2]通過Meta分析估計(jì)種植體周圍黏膜炎的患病率為43%。Mombelli等[3]通過長(zhǎng)達(dá)5-10年的縱向研究發(fā)現(xiàn)種植體周圍炎的患病率為20%左右。國際口腔種植共識(shí)會(huì)議[4]和國內(nèi)種植修復(fù)臨床評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]均提出種植體臨床評(píng)估級(jí)別分為4個(gè)等級(jí)，即成功、狀況良好、狀況一般和失敗。維護(hù)好種植體周圍軟硬組織健康是目前的研究熱點(diǎn)，其與生物力學(xué)、種植體設(shè)計(jì)和宿主的情況密切相關(guān)。口腔種植學(xué)教材指出[6]細(xì)菌是引起種植體周圍粘膜炎癥和邊緣骨吸收的主要病因，但對(duì)于微生物菌群的研究仍然相對(duì)欠缺。本研究根據(jù)種植體周圍健康狀態(tài)進(jìn)行分組，從臨床角度出發(fā)，研究種植體周圍健康狀態(tài)與微生物菌群的特性。

1.材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究對(duì)象選自2016年1月至2019年12月于中國人民解放軍總醫(yī)院口腔科進(jìn)行種植治療并完成冠修復(fù)5年內(nèi)的患者。經(jīng)篩選共納入27名患者的42顆種植體。本研究經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院人類倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：S2020-396-01）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡為18歲以上種植單冠患者；全身健康狀況良好；非吸煙；余留牙的牙周情況良好或經(jīng)牙周治療后可獲得良好牙周的患者；牙種植體均位于后牙區(qū)；骨水平種植體；未服用影響骨代謝的藥物。

排除標(biāo)準(zhǔn)：過去12周內(nèi)全身抗生素治療或預(yù)防性治療；牙種植周圍有急性炎癥；牙種植體手術(shù)中行引導(dǎo)骨組織再生手術(shù)者；夜磨牙、深覆患者；無牙頜患者；即刻種植。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 本研究根據(jù)國際種植體健康情況分級(jí)[4]和國內(nèi)種植修復(fù)臨床評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]記錄種植體周圍組織健康狀況，分為成功（Success，S 組）、狀況良好（Satisfactory survival，S.S 組）和狀況一般（Compromised survival，C.S 組)，三組種植體分別為15 顆、14 顆和13 顆。失敗組因種植體有松動(dòng)、骨吸收等問題，當(dāng)患者復(fù)診時(shí)種植體常已脫落，無法采集樣本，故未設(shè)計(jì)失敗組。所有種植體檢查均由接受過專業(yè)培訓(xùn)的1名口腔醫(yī)生進(jìn)行。國際種植體健康情況分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下所示。

1.2.2 臨床數(shù)據(jù)采集 使用專業(yè)牙周探針進(jìn)行探診檢查，記錄探診深度。初始植入牙種植體和患者復(fù)診時(shí)均需使用錐形束（NewTom 5G，意大利）對(duì)種植體進(jìn)行放射學(xué)檢查，并使用NNT 5.6分析軟件對(duì)種植體邊緣骨吸收進(jìn)行測(cè)量。

牙種植體效果臨床評(píng)估分級(jí)

測(cè)量方法[7]：植體植入后選取種植體-骨界面（First bone-implant contact，F(xiàn)BIC）為參考點(diǎn)。植體植入后即刻進(jìn)行影像學(xué)檢查，測(cè)量植體初始植入深度（Initial depth of implant placement，IDIP）與參考線之間的距離；患者復(fù)診時(shí)測(cè)量FBIC與參考線之間的距離。種植體邊緣骨吸收為FBIC與參考線的距離減去IDIP 與參考線的距離得到種植體邊緣骨吸收（單位用mm表示）。

1.2.3 齦溝液樣本采集 本研究取樣時(shí)間均為晴天上午，維持取樣地點(diǎn)溫度為25℃。①采樣前將標(biāo)有患者信息的標(biāo)簽貼于15ml無菌離心管；②去除齦上菌斑和牙石，用棉卷對(duì)相應(yīng)種植體進(jìn)行隔濕，氣槍吹干；③鑷子夾持30#無菌紙尖藍(lán)色部分，輕插入種植體近頰、頰、遠(yuǎn)頰齦溝內(nèi)直至有輕微阻力止。紙尖在該位置保持60秒之后立即取出；④一般采集6-8個(gè)無菌紙尖的量。采集完畢，立即將紙尖放入離心管內(nèi)，置于干冰上，15min之內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱待用。

1.2.4 16S rRNA 基因測(cè)序 采用CTAB 法提取DNA，使用PCR通用引物（341F和806R）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)域。在Bio-radT100梯度PCR 儀上進(jìn)行循環(huán)：98℃預(yù)變性1min，進(jìn)入30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增階段，每個(gè)循環(huán)含98℃、10sec 變性；50℃，30sec 退火，72℃，30sec 延伸，72℃保溫5min。對(duì)目的條帶進(jìn)行產(chǎn)物回收，運(yùn)用NovaSeq6000進(jìn)行高通量測(cè)序。本研究所有測(cè)序工作均委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 患者臨床數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，通過單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，采用Levene′s test 進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用LSD，方差不齊時(shí)，采用Tamhane。16S rRNA 基因測(cè)序中三組樣本間的微生物差異采用ANOSIM 分析檢驗(yàn)組間和組內(nèi)差異。定義P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1 患者信息 本研究共招募27名志愿者，其中男性15名，女性12名，年齡范圍為24-90歲，平均年齡52.48歲。采集患者牙種植體周圍的齦溝液，共計(jì)42個(gè)標(biāo)本，見表1。

表1 受試者種植體周圍平均骨吸收量和平均探診深度情況

2.2 稀釋曲線 稀釋曲線以樣本中抽取的測(cè)序數(shù)據(jù)量和對(duì)應(yīng)的物種數(shù)目（測(cè)序深度）構(gòu)建曲線，可直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量和樣本量的合理性。由圖1知，隨著序列數(shù)增加，三組樣本的曲線趨于平緩。說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，足以進(jìn)行后續(xù)微生物分析。

圖1 樣本稀釋曲線圖。S組：成功組；S.S組：狀況良好組；C.S組：狀況一般組。

2.3 多樣性分析Alpha 多樣性是指某個(gè)群落或生境內(nèi)部的多樣性，常與豐富度和多樣性息息相關(guān)。觀察Chao1 與ACE 指數(shù)可發(fā)現(xiàn)微生物群落豐富度。觀察Shannon 和Simpson 指數(shù)可發(fā)現(xiàn)微生物群落多樣性。由表2 可知，Chao1 指數(shù)顯示C.S組豐富度小于S組和S.S組但不具有顯著差異（P>0.05)。Shannon指數(shù)顯示（圖2）S.S組菌落多樣性高于S組和C.S組，與S組有顯著差異（P<0.05)。

圖2 三組樣本Shannon指數(shù)。S組：成功組；S.S組：狀況良好組；C.S組：狀況一般組；*，P<0.05，S組與S.S組比較。

表2 三組樣本Alpha多樣性指數(shù)

2.4 屬水平三組齦溝液菌群的比較 由圖3 可發(fā)現(xiàn)三組樣本的優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬（Streptoccus）、卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）、馬賽菌屬（Massilia）、羅氏菌屬（Rothia）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、普雷沃菌屬（Prevotella）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、密螺旋體屬（Treponema）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、奈瑟菌屬（Neisseria）等。圖4顯示三組樣本中相對(duì)豐度顯著不同的菌屬。種植體健康狀況由良好發(fā)展到一般時(shí)，棒狀桿菌屬相對(duì)豐度逐漸降低，致病菌產(chǎn)線菌屬（Filifactor）和Lentimicrobium 相對(duì)豐度逐漸升高，叢毛單胞菌屬（Comamonas）相對(duì)豐度顯著減少，且三組之間差異顯著（P<0.05）。與S.S 組和C.S 組相比，S 組中棒狀桿菌屬的相對(duì)豐度顯著增加（P<0.05）。與S組和S.S 組相比，C.S 組中產(chǎn)線菌屬和Lentimicrobium 的相對(duì)豐度顯著增加，叢毛單胞菌屬（Comamonas）的相對(duì)豐度顯著減少（P<0.05）。短波單胞菌屬（Brevundimonas）相對(duì)豐度在S.S 組最高，顯著高于S組和C.S組（P<0.05）。

圖3 三組樣本在屬水平上物種相對(duì)豐度柱形圖。S組：成功組；S.S組：狀況良好組；C.S組：狀況一般組。

圖4 三組樣本菌屬比較。S組：成功組；S.S組：狀況良好組；C.S組：狀況一般組。

2.5 三組齦溝液中細(xì)菌代謝差異 功能分析表明（圖5），與C.S組相比，S組和S.S組具有更多與生命活動(dòng)相關(guān)的代謝通路，例如氨基酸代謝和能量代謝。這些代謝途徑有利于細(xì)菌的繁殖生長(zhǎng)。C.S組中免疫系統(tǒng)、糖的合成和代謝以及內(nèi)分泌系統(tǒng)更加活躍。

圖5 PICRUSt功能預(yù)測(cè)。S組：成功組；S.S組：狀況良好組；C.S組：狀況一般組。

3.討論

種植體周圍病是影響種植體成功與否的重要因素之一，常由種植體周圍菌群失調(diào)導(dǎo)致。因此研究不同健康狀況下牙種植體的微生物特性具有一定臨床意義。故本研究基于種植體周圍病治療的決策樹，采用種植體健康情況分級(jí)[4,5]進(jìn)行分組，從臨床角度出發(fā)，研究種植體周圍組織不同健康狀況下齦溝液微生物特性。

Alpha 多樣性中的Shannon 指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，其值越大，表示群落的多樣性越高。三組樣本Shannon 指數(shù)顯示狀況良好組最大，狀況一般組次之，成功組最小。這說明狀況良好組微生物多樣性最大，狀況一般組次之，成功組最小。目前主流觀點(diǎn)[8,9]認(rèn)為種植體周圍有炎癥存在時(shí)，其微生物多樣性降低。本研究中狀況一般組比狀況良好組微生物多樣性低也證明了這一觀點(diǎn)。但對(duì)于狀況良好組比成功組微生物多樣性高這一結(jié)果，我們認(rèn)為是種植體周圍菌群平衡被破壞所致。當(dāng)種植體周圍有益菌和有害菌處于平衡時(shí)，種植體不易患病。一旦種植體周圍健康狀態(tài)受到威脅，平衡被打破導(dǎo)致微生態(tài)失衡，致病菌增加，即微生物多樣性增加。當(dāng)種植體周圍健康狀態(tài)破壞到一定程度，種植體周圍形成以致病菌為主的生境，即種植體周圍微生物多樣性減少。

在細(xì)菌屬水平，本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)線菌屬作為牙周炎重要致病菌，同樣是種植體狀況良好和狀況一般的致病菌屬，可見牙周炎和種植體狀況良好及狀況一般的致病菌屬相似，但本研究也發(fā)現(xiàn)一些特殊致病菌屬（如Lentimicrobium）。種植體周圍健康程度與產(chǎn)線菌屬和Lentimicrobium 的相對(duì)豐度成負(fù)相關(guān)。產(chǎn)線菌屬可定植并侵襲牙周組織，對(duì)牙周微生物菌群產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)患者牙周組織有炎癥時(shí)產(chǎn)線菌屬的發(fā)生率會(huì)增加，產(chǎn)線菌屬在炎癥發(fā)展中具有重要作用[10]。Tamura 等[11]也認(rèn)同這一觀點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)線菌屬與種植體周圍炎有關(guān)。更有學(xué)者認(rèn)為[12]，產(chǎn)線菌屬與牙周膿腫的形成有關(guān)。Lentimicrobium 是一種發(fā)酵菌，可通過發(fā)酵復(fù)雜有機(jī)物產(chǎn)生H2/CO2，易被微生物利用生成乙酸、乙醇和丁酸等，導(dǎo)致pH 值下降[13]。嚴(yán)重酸性條件和過度機(jī)械應(yīng)力對(duì)種植體表面涂層產(chǎn)生永久性破壞，導(dǎo)致金屬碎片溶解[14,15]，最后影響種植體周圍健康。成功組中鏈球菌屬、雷爾氏菌屬、奈瑟菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、叢毛單胞菌屬和棒狀桿菌屬的物種相對(duì)豐度顯著增加。多項(xiàng)研究均表明[16-18]，健康種植體周圍的鏈球菌屬、奈瑟氏菌屬、棒狀桿菌屬含量較高。奈瑟菌屬是革蘭陰性需氧或兼性厭氧球菌，對(duì)口腔內(nèi)菌斑形成起重要作用。一定條件下，奈瑟菌屬可降解菌斑內(nèi)乳酸成分，轉(zhuǎn)化為酸性物質(zhì)。雷爾氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和叢毛單胞菌屬均是具有抗逆功能的內(nèi)生細(xì)菌，無特殊情況不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面特征的菌落[19]。短波單胞菌屬（Brevundimonas）是革蘭陰性桿菌，大量存在于種植體狀況良好組。其毒力較低，感染風(fēng)險(xiǎn)不高，但一定條件下仍會(huì)引起潛在感染，甚至導(dǎo)致死亡[20]。

綜上所述，種植體周圍健康狀況由良好發(fā)展到一般時(shí)，種植體周圍炎癥由輕到重，微生物多樣性由高到低。這表明齦溝液微生物菌落在種植體周圍健康狀態(tài)中具有潛在作用。種植體周圍組織處于成功或狀況良好時(shí)，棒狀桿菌屬相對(duì)豐度較高，氨基酸代謝和能量代謝通路富集，這些途徑可能有助于細(xì)菌的定殖和繁殖。種植體周圍健康狀況一般時(shí)，微生物致病菌產(chǎn)線菌屬和Lentimicrobium相對(duì)豐度較高，免疫系統(tǒng)、糖的合成和代謝以及內(nèi)分泌系統(tǒng)通路更加活躍。后續(xù)我們可以嘗試研究種植體周圍齦溝液菌群對(duì)宿主機(jī)體信號(hào)通路的調(diào)控。本研究為種植體周圍健康狀態(tài)的維護(hù)提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)。