濃縮生長因子（CGF）對人根尖牙乳頭干細胞生物學特性的影響*

王景莉 馮保靜

年輕恒牙及未完全發育牙齒因齲病或牙外傷導致牙髓壞死或根尖周炎，其治療措施包括傳統的根尖屏障術、根尖誘導成形術以及近年來實施的牙髓血運重建，其生物學基礎是根尖區組織含有大量前體細胞。Sonoyama 等[1]首先將這部分處于未分化狀態的前體細胞分離培養，并命名為根尖牙乳頭干細胞（stem cells from apical papilla,SCAPs），進一步研究發現其具有高增殖率、較強的自我更新能力和多向分化潛能。研究顯示SCAPs長期高表達抗凋亡蛋白及端粒逆轉錄酶，且來源于同一牙齒的SCAPs 較其他牙源性干細胞具有更強的增殖、分化能力[1-3]。另外，SCAPs具備更強的抗感染能力，當牙髓組織感染將導致牙髓干細胞失去活力，SCAPs 仍可繼續保持其活性，這是由于其所處的生長環境血運側支循環較髓腔內的牙髓干細胞更為豐富[4]。SCAPs 作為組織工程中極具潛力的種子細胞，其出現為牙齒修復再生及組織重建再生提供了新的思路。

CGF 是近年來發現的一種新型血液來源的生物支架材料，由靜脈取血后通過差速離心制作而成[5]。CGF 作為繼富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）、富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）后的新一代血小板濃縮物，其不僅是新一代生物支架材料，富含多種高濃縮的纖維蛋白（fibrous protein）及生長因子（growth factor），包括血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor,PDGF）、轉移生長因子-β（Transferring growth factor-β,TGF-β）、類胰島素生長因子（insulin-like growth factor,IGF）以及成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors,FGF）等[6]。研究報道CGF 既有利于骨髓間充質干細胞的分化，又能促進牙齦細胞增殖、粘附及膠原纖維的合成，加快軟組織愈合[7-8]。另外，CGF 的制備不需要特殊的添加劑，其纖維蛋白的三維網狀結構與天然纖維蛋白網絡更加相似，制備后捕獲的多種生長因子可在后期節律性緩慢釋放[6,9]，使得CGF 在牙髓損傷修復及及組織工程再生領域具有廣闊臨床應用前景。

目前研究發現自體CGF 可顯著促進SCAPs增殖、遷移及成骨向分化，但患有貧血等血液疾病者其自體CGF 的使用受到了限制，那么異體CGF 是否能夠發揮同樣的作用尚不明確，為闡明人異體CGF 對SCAPs 影響的差異，本實驗通過制取異體CGF，檢測其對SCAPs 生物學特性的影響，為異體CGF的臨床應用提供實驗依據。

1.材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰酶細胞消化液、α-MEM 培養基（Hyclone，美國）；CCK-8（DOJINDO，日本）；ALP試劑盒（碧云天，中國）；紫外線分光光度儀（Eppendorf，德國）；細胞培養板（Costar，美國）；實時定量PCR儀（ABI，美國）；細胞培養箱（Heraeus，德國）；逆轉錄試劑盒（Takara，日本）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；胎牛血清（FBS）；（Hyclone，美國）；酶聯免疫檢測儀（BIO-TEK，美國）；細胞培養板（Costar，美國）；CD29、CD90、CD105、CD34、CD45（BIOLEGEND，美國）；牛血清白蛋白（BSA)（Biosharp，中國）。

1.2 hSCAPs 的分離、培養及鑒定 口腔頜面外科收集12名15-22歲志愿者正畸拔除前磨牙及第三磨牙，要求牙齒完整無齲壞且根尖未發育完全，其中6名志愿者同期抽取靜脈血，進行自體CGF 膜片制備。拔除牙齒立即放入冰浴PBS 中，超凈臺內反復沖洗牙齒表面并去除牙齦、牙周膜軟組織，使用手術刀片分離出根尖牙乳頭組織放入1.5mL EP 管，使用眼科剪將根尖牙乳頭組織塊剪碎至1mm3大小，加入Ⅰ型膠原酶（3mg/mL），輕柔混勻后放入37℃細胞培養箱中消化45min，10min使用移液槍混勻一次，終止消化、離心去上清，細胞重懸并接種于培養瓶中，待細胞融合率達80%左右時，擴大培養用于后續實驗。

流式細胞術鑒定：取第3代hSCAP接種于培養瓶，當hSCAP融合率達80%左右，消化細胞為單細胞懸液后離心，0.5%牛血清白蛋白（BSA）重懸細胞，在流式細胞儀樣品管中分別加入1mL細胞懸液（1×106個/mL），常溫下孵育細胞懸液與目標抗體（CD29、CD90、CD105、CD34、CD45、IgG）1h，1000r/min離心后去上清，PBS洗脫未結合抗體，上機檢測表面標記物。

hSCAPs 成骨向誘導及成脂向誘導培養：當根尖牙乳頭干細胞生長融合率達80%左右時，將完全培養基更換為成骨誘導培養基或成脂誘導培養基[9]，定期更換誘導培養基，誘導培養4周后使用4%多聚甲醛固定細胞15min，使用三蒸水洗脫殘留多聚甲醛，參照茜素紅及油紅O染色說明書進行染色，顯微鏡下觀察并記錄脂滴及鈣化結節形成情況。

1.3 CGF膜片的制備 經安陽市第六人民醫院倫理委員會審批同意，在口腔頜面外科招募12名15-22歲男性志愿者，要求身體健康，無系統性疾病，使用真空采血試管采取其中6名志愿者前臂靜脈血，其余6名志愿者拔除前磨牙或第三磨牙，進行根尖牙乳頭干細胞培養。采血管放入離心機，不間斷差速離心13min，即可得到CGF 纖維蛋白層，此時可見真空管內血液分為三層，中間層即為CGF凝膠。采血管內取出CGF凝膠，制備CGF膜，裁剪備用。hSCAPs 患者之外志愿者來源的CGF 為異體CGF（homogenous CGF,H-CGF）。

1.4 CCK8檢測細胞增殖 將異體CGF膜裁剪至標準膜的1/2 及1/4 大小，并置于96 孔板中，取20μl 濃度為5×105/ml 的細胞懸液接種于96 孔板不同體積的異體CGF 上，培養箱中靜置2h，待細胞附著后，補加培養基至l00μl，繼續培養7d 后，更換為CCK-8 工作液孵育2h，酶聯免疫檢測儀測定各組在1、3、5、7d時450nm處吸光度（OD）值。

1.5 ALP 活性檢測 將異體CGF 置于6 孔板中，狀態良好的細胞消化離心，并使用不同的培養基重懸，空白對照組（Con）使用單純α-MEM 重懸細胞，成骨誘導組（Osteogenic differentiation Medium,OM）及CGF 組均使用成骨誘導培養基重懸細胞，接種于6 孔板及異體CGF 上培養24h，然后更換為成骨誘導液繼續培養7d、14d，對照組（Con）更換為不含CGF 膜的成骨誘導液，根據說明書測定各組ALP活性。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應檢測成骨/成牙基因表達 成骨誘導培養液條件下培養7d，提取細胞總RNA 并逆轉錄成cDNA，以cDNA 為模板，采用Real Time-PCR 檢測各組ALP、DSPP、BSP、OCN 成骨/成牙相關基因的表達，以β-actin 為內參基因。Real Time-PCR 反應條件及反應體系參照說明書操作，引物序列見表1。

表1 成骨相關基因引物序列

1.7 Transwell 檢測細胞遷移采用無血清a-MEM 和完全培養基重懸細胞，不含血清的a-MEM 為空白對照組（Con），含10%FBS 的a-MEM 為陽性對照組（positive group,PG），含10%FBS 的a-MEM 加CGF 膜片為H-CGF 組，在24 孔板Transwell 小室的下層加入600μL 培養液及異體CGF 膜，取150μL（5×104/ml）細胞懸液接種于小室，培養24h 后，多聚甲醛固定小室上遷移的細胞，用小棉簽擦去小室上層為遷移細胞，1g/L結晶紫染色液20min，清洗后顯微鏡下觀察并記錄細胞遷移數量。

1.8 統計學分析 采用SPSS 13.0 軟件對數據作單因素方差分析，組間比較采用t 檢驗或方差分析，實驗均各重復3次，數據為均數±標準差，P<0.05具有統計學意義。

2.結果

2.1 hSCAPs 的培養及鑒定hSCAPs 成骨、成脂向誘導4 周后，茜素紅染色可見成骨誘導組細胞可形成大量鈣化結節（圖1），而油紅O 染色可見成脂誘導組細胞內有紅色脂滴形成（圖2），說明hSCAPs具有多向分化潛能。流式結果顯示干細胞表面標記分子CD105、CD90、CD29呈陽性表達，而血細胞標記分子CD34、CD45 則呈陰性表達，符合間充質干細胞的表面分子表達特性（圖3）。

2.2 CGF對hSCAPs增殖能力的影響

CCK-8 檢測結果顯示，異體CGF 組（H-CGF）和對照組在培養hSCAPs 1、3、5、7d 時，不同濃度的H-CGF 均明顯高于其對照組的OD值，表明CGF 可提高hSCAPs 的增殖率（P<0.05)；但不同膜片大小的H-CGF 組間無顯著性統計學差異（P>0.05)，提示促進hSCAPs 增殖能力的CGF不具有濃度依賴性（圖4)。

2.3 CGF 對hSCAPs成骨/成牙能力的影響

成骨誘導組（OM）的ALP 活性在hSCAPs 成骨誘導培養7d、14d 時均明顯高于空白對照組（P<0.05)，且H-CGF 組的ALP 活性顯著高于OM 組（P<0.05)，(圖5)。qPCR 檢測結果顯示H-CGF 組中成骨基因ALP、DSPP、BSP、OCN mRNA 的表達均明顯高于OM 組，差異有統計學意義（P<0.05)，(圖6)。

2.4 CGF 對hSCAPs遷移能力的影響

Transwell 結果發現，陽性對照組（PG）遷移至下室的細胞數目明顯高于空白對照組（Con）(P<0.05)，且H-CGF 組遷移至下室的細胞數目均明顯高于陽性對照組（PG）(P<0.05),(圖7)。

3.討論

SCAPs 位于牙根未發育完全的年輕恒牙及乳牙中，其具有高度增殖能力和成骨/成牙分化能力，在牙根發育過程中發揮著重要作用[10]。研究發現將SCAPs復合培養于羥基磷灰石（HA-TCP）支架材料后植入裸鼠皮下，4-8 周后可形成類牙齒樣結構[11]，提示SCAPs 在牙齒修復再生及組織重建中起著重要作用。

由于CGF 具備更加接近天然結構的纖維網狀支架，并能更好的富集高濃度生長因子，使得CGF迅速成為研究熱點[12]。此外，CGF 纖維支架中各組生長因子的釋放更接近組織愈合的自然過程，在軟、硬組織愈合過程中的發揮的作用更強[9]。研究發現，CGF 刺激間充質干細胞后，可通過TGF-β/BMP、Wnt/β-catenin 等通路上調干細胞內成骨基因的表達，進而調控細胞成骨向分化，促進骨組織再生[13]。Hong 等[14]發現，CGF 內的細胞因子可趨化牙髓干細胞聚集，促進細胞增殖和分化，在根尖周炎中炎癥性牙髓的再生中發揮重要作用。Ding 等臨床研究表明CGF 在牙髓再生治療中可發揮緩慢釋放細胞生長因子和作為細胞生長支架的雙重作用，不僅能替代牙髓血運重建傳統治療中的血凝塊，還可提高牙髓再生治療的成功率[15]。體外研究顯示自體CGF 可促進PDLSC 的增殖、成骨向分化能力[16]，而hSCAP 在牙根的形成和發育中發揮關鍵作用，尤其是根尖誘導成形術中牙根繼續發育的重要細胞來源，明確CGF 對SCAP 生物學特性的影響對CGF 在牙組織工程中的應用具有重要意義。

本研究選取異體CGF對hSCAPs進行培養，檢測hSCAPs 的增殖、遷移及成骨/成牙分化等生物學特性。CCK8 實驗結果顯示，異體CGF 在第1、3、5、7d均可明顯促進hSCAPs的增殖。此外，本研究發現異體CGF 對SCAPs 成骨/成牙向分化具有顯著促進作用。細胞遷移實驗則顯示異體CGF 對hSCAPs 遷移能力具有明顯促進作用。研究表明，制備CGF 過程中，真空離心管的不同規格可使最終獲得的CGF 纖維支架具有一定的差異[17]，并且不同志愿者的身體狀況、年齡、性別及生活習慣等差異較大，則制備出的CGF 在濃度和活性方面也會產生較大差異[18]；因此，本實驗制備CGF 時選用18-20歲健康男性志愿者，并采用同一批次靜脈血采集管，以減少年齡、性別差異引起的實驗誤差。

綜上，CGF 作為繼PRP 和PRF 后的最新一代血小板纖維蛋白濃縮物，其類似天然的支架結構可為細胞提供生長及增殖的空間，且富含多種細胞生長因子并具有可吸收性生物膜的特性，在牙髓-牙本質再生中可發揮重要作用。本研究顯示異體CGF 可明顯促進SCAPs 增殖、遷移能力，增加堿性磷酸酶活性、提高成骨/成牙相關基因的表達水平，促進成骨/成牙向分化，為異體CGF 在口腔組織工程的臨床應用提供理論基礎。