雌激素對去卵巢大鼠下頜下腺血管活性腸肽VIP及功能的影響*

羅小鳳 秦麗華 達云萌 白 蕓 孫艷榮 王子月 賈 靜

絕經(jīng)是由于自然或手術導致卵巢功能喪失而引起的月經(jīng)停止超過6個月的生理過程，多發(fā)生于50歲左右的女性。在更年期綜合癥中，除潮熱、盜汗、性交困難等常見癥狀外，眼干、口干等癥狀也明顯增多，以往研究證實絕經(jīng)后激素生成減少可能導致唾液分泌量顯著下降，引起口干癥等，而雌激素治療可改善絕經(jīng)后的口干癥狀[1]，但其通過何種方式調控唾液分泌尚未有定論。

血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）是一種直鏈鈦，屬胰泌素/胰高血糖素家族，參與調控多種生理功能，如蛋白分泌、抗凋亡以及免疫調節(jié)等[2]。VIP可能與絕經(jīng)后的多種癥狀相關并受到雌激素的調控。Liu X等研究表明，VIP可能參與絕經(jīng)期骨質疏松癥的發(fā)病過程[3]。Lara,L.A等研究顯示雌激素能夠通過調控陰道后壁中VIP的表達，影響陰道分泌功能[4]。VIP主要通過與其受體結合發(fā)揮作用，受體包括VIP-1 受體（VPAC1）、VIP-2 受體（VPAC2）、PAC1，其中VPAC1與VIP的結合有高度親和力，因此對于VIP受體的研究多選擇VPAC1[5]。截至目前，VIP在絕經(jīng)后下頜下腺中表達以及對其功能的影響尚未見文獻報道。

1.方法和材料

1.1 動物模型60只8-10周齡（體重220±10g）雌性SD大鼠[6]，隨機分為：假手術組（SHAM），去卵巢組（OVX）和去卵巢后雌激素干預組（OVX+E），每組20只。置于25±1℃,相對濕度40-50%，光暗周期12h的環(huán)境中，非直接光照，自由飲水，無大豆飼料飼養(yǎng)兩周。所有實驗程序已獲得當?shù)氐赖略S可，并遵守中國公共衛(wèi)生部護理和使用實驗動物指南。本研究經(jīng)過北京大學健康科學中心倫理委員會批準（the approval number:LA2012-82）。

SHAM 組，只打開盆腔找到卵巢，切除卵巢周圍相同重量的脂肪，卵巢未切除；OVX 和OVX+E組大鼠實施雙側卵巢切除術[7]。恢復兩周后，OVX+E 組根據(jù)25 μg/kg 每日腹腔注射雌二醇[8,9]（17β-雌二醇，Sigma E8875），SHAM 和OVX 組大鼠腹腔注射等量芝麻油，給藥四周后每組剔除4 只體重明顯異常的大鼠，剩余每組16 只局麻下進行心臟取血測定血清雌二醇含量以及處死后摘取下頜下腺組織。

1.2 免疫放射法測定血清雌二醇 所有大鼠麻醉后，暴露心臟，使用注射針提取心臟血液3-4ml，在4℃，3500rpm條件下離心15min，吸取上清液使用放射免疫試劑盒檢測大鼠體內(nèi)雌二醇含量[10]。

1.3 下頜下腺取材 完成心臟取血后，每組取8只大鼠，用4%多聚甲醛心臟灌流后剪取下頜下腺組織，制作冰凍切片用于免疫組化。每組剩余8 只處死后，直接摘取下頜下腺組織，將外側包膜剝離后-80℃保存，用于免疫印跡和sAA活性測量。

1.4 免疫組織化學 常規(guī)將冰凍切片（厚度10μm）Triton-X100 打孔，抗原修復后，使用VIP抗體（稀釋濃度1∶400,Abcam,ab272726）和VPAC1 抗體（稀釋濃度1∶500，杭州華安生物，ER65303）在4℃下孵育16h，滴加生物素山羊抗兔IgG 孵育3h，滴加辣根酶標記鏈酶親和素孵育1.5h，DAB 顯色，每個組織在顯微鏡下觀察并在同一放大倍數(shù)時，隨機選取5 張視野進行拍攝[11]。陰性對照組在一抗孵育時使用0.01mol/L PBS 溶液，其余步驟同實驗組。

1.5 免疫印跡 稱取0.4-0.6mg 下頜下腺組織進行蛋白提取，電泳槽中加入等量蛋白提取液（80μg）100V 電壓下電泳1.5h，接著電轉2h 將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，進行目標蛋白抗體孵育18h（VIP,VPAC1 稀釋濃度均為1∶1000），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L）孵育2h 后進行曝光，使用Image J 軟件計算灰度值[12]。

1.6 微量法sAA 活性檢測 sAA 能夠催化α-1，4-糖苷鍵水解生成還原性糖，還原3，5-二硝基水楊酸產(chǎn)生棕紅色，在540nm 波長處出現(xiàn)吸收峰，可通過測量吸光度獲得sAA 活性。組織破碎后提取粗酶液，設置對照管，測定管，標準管和空白管，按照說明依次加入相應試劑，測定吸光度，繪制標準直線（y=kx+b）計算sAA 活性（每克組織每分鐘催化生成1mg 還原糖定義為1個酶活性單位）：sAA（U/g）=2×x÷W（W為樣本鮮重）[13]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，SPSS 17.0 軟件分析結果。三組間VIP、VPAC1表達及sAA 活性之間的差異使用單因素方差分析（ANOVA），組間差異使用事后多重分析（SNK檢驗），P<0.05具有統(tǒng)計學意義[14]。

2.結果

2.1 大鼠血清雌二醇含量 放射免疫法結果顯示，OVX組大鼠體內(nèi)雌二醇含量（8.643±4.226pg/ml）較SHAM 組（16.331±2.150pg/ml）明顯減少（P<0.05），OVX+E組含量增加（15.715±4.816pg/ml）接近SHAM組水平（P>0.05），（圖1）。

圖1 大鼠血清雌二醇含量（S±SD)：（*P<0.05，n=8）。

2.2 大鼠下頜下腺VIP 的表達 免疫組化結果顯示，血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide,VIP）在大鼠下頜下腺腺泡細胞的細胞核及細胞漿中均有表達（圖2 B-D）。VIP 在OVX 組下頜下腺的細胞核及細胞漿中表達相比于SHAM 組明顯減低，OVX+E組表達水平與SHAM組相似。

圖2 VIP在大鼠下頜下腺的免疫組化染色（S±SD)A：陰性對照；B：SHAM組；C：OVX組；D：OVX+E組；箭頭示：VIP的表達位置，標尺：30 μm。

免疫印跡結果顯示，OVX 組下頜下腺中VIP表達（1.12±0.09）比SHAM 組（1.92±0.12）明顯減少（P<0.01），OVX+E 組（1.77±0.11）增加到SHAM組水平（P>0.05），（圖3 A,B）。

圖3 VIP在大鼠下頜下腺的免疫印跡結果（S±SD)A:VIP的免疫印跡蛋白表達；B:VIP的免疫印跡灰度值統(tǒng)計；（**P<0.01，n=8）。

2.3 大鼠下頜下腺VPAC1 的表達 免疫組化結果顯示，血管活性腸肽受體VPAC1 在大鼠下頜下腺腺泡細胞細胞核核膜和細胞膜上均有表達（圖4 B-D）。OVX 組下頜下腺中VPAC1 表達較SHAM 組明顯減少，OVX+E 組表達基本恢復到SHAM組水平。

圖4 VPAC1在大鼠下頜下腺的免疫組化染色（S±SD)A:陰性對照組；B:SHAM組；C:OVX組；D:OVX+E組；箭頭示VPAC1表達位置，標尺：30 μm。

免疫印跡結果同免疫組化相同，灰度值分析（S±SD）結果，OVX 組下頜下腺中VPAC1 表達（4.46±1.43）較SHAM 組（8.64±0.42）明顯減少（P<0.05），OVX+E 組（8.50±2.30）增加到SHAM組水平（P>0.05）。（圖5 A,B）

圖5 VPAC1在大鼠下頜下腺的免疫印跡結果（S±SD)A:VPAC1的免疫印跡蛋白表達；B:VPAC1的免疫印跡灰度值統(tǒng)計；（*P<0.05，n=8）。

2.4 大鼠下頜下腺sAA活性sAA由漿液性腺泡細胞分泌產(chǎn)生，微量法活性檢測分析（S±SD）結果顯示，OVX 組下頜下腺分泌sAA 活性（0.34±0.80）較SHAM 組（0.72±0.28）明 顯降低（P<0.05），OVX+E 組（0.65±0.28）活性升高接近SHAM組水平（P>0.05），（圖6）。

圖6 下頜下腺中唾液淀粉酶活性（S±SD)；（*P<0.05，n=8）。

3.討論

本實驗通過檢測大鼠體內(nèi)血清雌二醇含量,確保大鼠去卵巢模型成功建立[7]。雌激素通過雌激素受體，參與調節(jié)細胞內(nèi)許多蛋白和肽類的表達[15]。雌激素與雌激素受體特異性結合后發(fā)揮生物學效應，主要的受體亞型為：ERα、ERβ 和GPR30。下頜下腺中三種雌激素受體均有表達，其中ERα 僅在導管細胞表達[16]，而ERβ 和GPR30在漿液性腺泡細胞中均有表達[17,18]，與本實驗中VIP 及其受體的表達位置一致。有研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女陰道后壁中雌激素受體ERα 表達減少可導致VIP 的表達減少[4]；小鼠SCN 神經(jīng)元中雌激素可通過受體ERβ 影響VIP 的表達，繼而維持細胞的晝夜節(jié)律[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)垂體中GPR30 能夠與受體活性修飾蛋白3(RAMP3）特異性結合調控VIP 的表達[20]。因此，我們推測雌激素很可能通過各種雌激素受體調控腺泡細胞中VIP 和VPAC1 表達，但具體機制仍需進一步實驗探索和驗證。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)去卵巢后大鼠下頜下腺細胞凋亡和氧化應激增加，腺泡萎縮，結構出現(xiàn)異常[7]，這也可能是導致VIP 和VPAC1 表達減少原因之一。另外VIP 對VPAC1 具有調節(jié)作用[21]，VIP 表達減少后可能導致兩者結合減少，長期失代償后VPAC1表達亦減少。

圍絕經(jīng)期女性唾液中多種成分發(fā)生改變[22]。α-唾液淀粉酶（salivary alpha-amylase,sAA）是唾液中十分重要的有機成分，是唾液腺代表性功能指標之一。它能夠將淀粉和糖原水解，其分泌和活性異常能夠導致食物無法成團和初步消化，出現(xiàn)咀嚼和吞咽困難[23]。本實驗結果顯示大鼠在低雌激素狀態(tài)下，下頜下腺分泌的sAA 活性降低，給與雌激素治療后，活性顯著提高，表明雌激素能夠影響下頜下腺sAA 的活性，這與Purushotham K R等的研究結果相似，該研究采用了與我們的實驗設計相同的去卵巢動物模型并測量了唾液腺中提取的sAA活性[24]。而部分臨床研究顯示，使用雌激素治療后的絕經(jīng)后婦女唾液中的sAA 活性隨日間采樣時間不同呈現(xiàn)規(guī)律變化，而不使用激素治療的絕經(jīng)后婦女唾液中的sAA 的活性日間規(guī)律被打亂，這可能與絕經(jīng)后婦女在基礎和應激條件下腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)和腎上腺皮質（hypothalamus -pituitary -adrenal，HPA）軸活動之間存在不對稱性導致。雌激素治療通過減少交感神經(jīng)活動進而改變異常的腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)活動維持了唾液腺細胞的晝夜節(jié)律。N Yoshida 等人的研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前、圍絕經(jīng)期、絕經(jīng)后婦女的血清雌二醇含量及靜息唾液流量依次顯著減少，但sAA 活性并沒有顯著差異，根據(jù)皮爾遜相關系數(shù)計算得出雌二醇與sAA 活性呈負相關的結論，但該實驗測量的樣本是靜息唾液，而研究顯示唾液淀粉酶在咀嚼或酸性食物刺激時才會大量分泌到唾液中[25,26]，此實驗中的sAA 活性僅能作為精神壓力指標，不能作為功能標志，故與我們的實驗結果并不矛盾[27]。

實驗結果顯示，去卵巢后大鼠下頜下腺中VIP,VPAC1 表達減少，同時sAA 活性降低。另有研究發(fā)現(xiàn)在免疫細胞中特異性激動和拮抗VPAC1，使血清中淀粉酶含量發(fā)生變化，表明VPAC1 對血清淀粉酶具有調控作用[28]。給與大鼠唾液腺細胞外源性VIP 刺激，sAA 活性顯著提高[29]。以上結果均提示下頜下腺中sAA 活性變化可能與VIP 和受體VPAC1 異常表達具有一定相關性。可能原因有：（1）下頜下腺中VIP 和VPAC1 表達和結合減少，可能使細胞內(nèi)cAMP 或Ca2+含量改變，而下頜下腺漿液性腺泡細胞能夠在cAMP 刺激下合成和分泌sAA，導致sAA 活性降低[30]；（2）下頜下腺中VIP 能夠通過蛋白激酶PKA 途徑抑制腫瘤壞死因子TNF-α 介導的細胞凋亡，VIP 表達減少可能導致腺泡細胞凋亡增多，分泌sAA 減少，活性降低[31]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)去卵巢后三大唾液腺出現(xiàn)腺泡細胞萎縮，凋亡細胞與氧化應激現(xiàn)象加劇，毒蕈堿乙酰膽堿受體M1、M3 和水通道蛋白5表達減少等[12]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)低雌激素狀態(tài)與VIP 及其受體VPAC1 的表達具有一定相關性，這一過程可能導致唾液腺功能發(fā)生變化，進而引起圍絕經(jīng)期女性口干、味覺異常等不適感。本研究為揭示圍絕經(jīng)期女性唾液分泌成分變化及其可能機制提供了新的線索，為深入研究圍絕經(jīng)期女性唾液分泌功能障礙提供新的思路。