依普黃酮對骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的線粒體相關因子的影響

于書娟 劉洪臣

由于頜骨作為全身骨骼的一部分,在很多方面是相似的,有研究表明，全身骨的骨量減少與頜骨的骨量減少非常相似，并且有一定的相關性[1-3]，所以很多學者在頜骨的骨量減少的防治上使用全身骨質疏松癥的治療藥物。依普黃酮（ipriflavone，IP）是人工合成的異黃酮，已被報道能增加骨質疏松患者的骨密度[4]并具有抗氧化特性[5]，其雖然具有雌激素的作用，但對子宮內膜和乳腺的刺激作用小于雌激素[6，7]，作為骨質疏松癥藥物在臨床已經應用多年，并且引起口腔醫學者的關注。有學者研究發現依普黃酮可以促進牙周膜細胞的體外增殖和成骨分化，促進牙齒移動后的牙周組織的重組，預防正畸后的復發[8]。也有學者的研究結果提示依普黃酮可以增加頜骨的骨密度[9],從而對頜骨的骨質疏松有一定的防治效果。本實驗通過研究依普黃酮對骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的線粒體相關因子解偶聯蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的影響，為依普黃酮應用于口腔頜骨骨質疏松防治的研究提供理論基礎，并且初步探索其分子作用機制。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和設備 依普黃酮（Sigma，美國），杜爾貝科改良伊格爾培養基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）（Gibco，美國),胰蛋白酶（Amresco，美國），新生牛血清（四季青，杭州），胎牛血清（Gibco，美國)，培養細胞總RNA 提取試劑盒（TIANGEN，北京），逆轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒（TIANGEN，北京），SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（BOSTER，武漢），總蛋白抽提試劑盒（BOSTER，武漢），辣根酶標記的山羊抗兔IgG（Santa，美國），兔抗鼠UCP2 單克隆抗體（BOSTER，武漢）。其余試劑為國產分析純。

雙能X 線骨密度儀（Lunar，美國），ELx800uv全自動酶標儀（Bio-Tek，美國），倒置相差顯微鏡（Leica,德國),紫外分光光度計（Beckman-DU640，美國）,多功能熒光分析儀（FLUOstar Omega，BMG LABTECH，德國），TDZS-WS 型多管架自動平衡高速離心機（湘儀公司，長沙），低溫高速離心機（Eppendorf，德國），ST-Ⅰ型半干式轉移電泳槽（競邁生物，大連）。

1.2 動物來源20 只SD 大鼠（雌性，12 周齡，約300g）在實驗動物房中進行適應性喂養，觀察一周，大鼠均健康。

1.3 骨質疏松大鼠動物模型的建立 實驗大鼠被隨機平均分為兩組[去勢組（n=10）和假手術組（n=10）]。麻醉后取仰臥位，正中切開腹部，去勢組對雙側卵巢結扎切除，假手術組對雙側卵巢附近的與卵巢大小相似的小塊脂肪切除，嚴密縫合腹部傷口，術中注意無菌操作，術后注射抗生素防止感染。大鼠在術后12 周時，通過綜合分析評價，成功建立骨質疏松動物模型[10]。

1.4 骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的培養和傳代 全麻下處死已建立骨質疏松模型的大鼠，無菌條件下取出下頜骨，去除頜骨上的肌肉和筋膜，完整的拔除頜骨上的牙齒，運用課題組人員熟練使用的成骨細胞培養方法，即組織塊法和酶消法共同培養的方法[10，11]。首先，在無菌器皿中用無菌剪刀將下頜骨，剪成約2mm 直徑大小的骨片，倒入0.125%胰蛋白酶將骨片完全覆蓋，約8min 后，將首次消化的液體倒掉。再用胰蛋白酶連續消化骨片5次，依次收集，高速離心，將離心管中上清液棄去，管底部細胞重懸后接種到培養瓶中。然后胰蛋白酶消化后留下的骨片加入培養基，繼續用無菌剪刀將骨片剪成約1mm 直徑大小，倒入培養瓶中培養。待成骨細胞長滿全瓶后傳代。

當培養的成骨細胞在培養瓶中達到約80%的融合率時，換成不含血清的培養基繼續培養24h,以使得細胞達到同步化，然后將細胞分成依普黃酮組和對照組，分別采用含10-8M 依普黃酮[12]的培養基和不含依普黃酮的培養基培養成骨細胞72h。然后進行ATP含量檢測、ROS含量檢測、UCP2的RT-PCR基因檢測和UCP2 的western blot 蛋白檢測。

1.5 成骨細胞的ATP 含量檢測 將成骨細胞以3×105細胞/ml 接種于5個6 孔板，用無血清培養基同步化，每個6 孔板中3個孔使用藥物干預，3個孔用作對照。藥物干預72h 后。使用ATP 檢測試劑盒（Beyotime，中國）中提供的試劑，溶解成骨細胞10min。溶解后，混合物在12000g 和4oC下離心10min。將ATP 檢測工作液在不透明的96孔板中孵育5min，以減少ATP 的背景。然后將離心后的成骨細胞上清液轉移到96 孔板中2s，立即用多功能熒光分析儀（FLUOstar Omega，BMG LABTECH，德國）在562nm 波長下測量化學發光（熒光素酶催化熒光素產生熒光）。根據標準曲線計算出ATP 濃度。

1.6 成骨細胞的ROS 含量檢測 將成骨細胞以1×106細胞/ml 的密度接種于5個6 孔板，每個6 孔板中3個孔使用藥物干預，3個孔用作對照。細胞同步化和藥物干預培養后，用PBS 洗滌細胞兩次，并將用無血清培養基稀釋的DCFH-DA 探針（1∶1000 稀釋）添加到培養板中，繼續培養細胞20min 后，用無血清培養基連續洗滌3次，用于去除多余的DCFH-DA，然后以800 轉/分離心6min。用PBS 洗滌細胞并在0.3ml PBS 中重新懸浮，將0.2ml 含有細胞的懸浮液轉移到96 孔板中，用多功能熒光光分析儀（FLUOstar Omega，BMG LABTECH，德國）測量熒光（488nm 的激發/波長，525nm 的散發波長）。通過減去自身熒光背景校正，最終獲得成骨細胞的ROS 含量。

1.7 RT-PCR 將成骨細胞以1×105細胞/ml接種于3個12 孔板，每個12 孔板中6個孔使用藥物干預，6個孔用作對照。培養72h 后，用PBS 連續沖洗三次，用總RNA 提取試劑盒抽提成骨細胞的總RNA。用逆轉錄聚合酶鏈反應式試劑盒反轉錄1.5μg 的mRNA 為cDNA，進行PCR。引物的合成通過專業生物技術公司（上海英俊公司，中國）完成，見表1。

表1 用于RT?PCR的基因引物

每個25μl 的PCR 反應體系包括1.5μl 的cDNA，0.5μl 的dNTPs（10mM），2.5μl 的10×PCR 緩沖液，0.5μl 的β-肌動蛋白f（25pmol/ul），0.5μl 的β-肌動蛋白r（25pmol/ul），0.5μl的Taq 酶（2u/ul）和ddH2O（補足至25μl）。設置循環參數，在94℃預變性2min，再按94℃/30s、63℃/30s 和72℃/30s 擴增30個循環。然后用瓊脂糖凝膠電泳30min，獲得圖像，用Labworks 4.0 圖像采集分析軟件（PerkinElmer，Waltham，Massachusetts，USA）對各條帶積分光密度值（IOD）進行分析，以目標基因與GADPH 基因的IOD 值之比作為目標基因表達水平，每一個樣品分析三次。

1.8 Western Blotting 將成骨細胞以1×105細胞/ml接種于3個12孔板，每個12孔板中6個孔使用藥物干預，6個孔用作對照。藥物干預培養72h后，將待檢測的成骨細胞用PBS洗滌三次后加入細胞裂解液，冰上輕搖晃15min。刮取各孔的成骨細胞并且收集于1.5ml試管中，在12000g下4℃離心15min，上清液經標準化后分裝。含有等量蛋白質（30μg）的成骨細胞上清液，用、SDS-PAGE 分離蛋白，電轉移至PVDF膜。轉移后，用40ml的0.1%Tris緩沖鹽水吐溫（Tris-Buffered Saline Tween-20，TBST）洗滌緩沖液（含5%脫脂乳，pH值7.4）并在4℃下過夜封閉，加入稀釋度1∶300的兔抗鼠UCP2抗體（BOSTER，武漢），稀釋度1∶2000的β-肌動蛋白，在37℃下孵育2h后，洗滌膜三次后，加入稀釋度1∶2000的辣根酶標記的山羊抗兔IgG（Santa，美國），繼續37℃下孵育1h，滴加化學發光試劑，X光片盒中曝光。通過Quantity One軟件分析得出結果。以β-肌動蛋白的百分比表示成骨細胞的UCP2蛋白表達。

1.9 統計學方法 采用統計軟件SPSS 25.0進行實驗數據的統計分析，數據結果采用平均值±標準差的方式表示，對于依普黃酮組和對照組之間數據的比較采用t檢驗，P<0.05認為兩組間有顯著性差異。

2.結果

2.1 倒置顯微鏡下成骨細胞的形態觀察 骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的形態如圖1 所示，多呈長梭形、三角形或多角形等多種形態，有多個長或短突起，與相鄰的細胞連接；細胞核呈圓形或橢圓形，居于細胞中間或略偏向一側，可看到明顯的一個或兩個核仁；在細胞重疊生長的區域，可見緊靠的多個細胞核。

圖1 骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞（×200）

2.2 成骨細胞ATP 含量檢測的結果 骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞ATP 含量的熒光檢測結果如圖2 所示，依普黃酮組（15.3±1.31μmol/g）明顯高于對照組（9.9±0.78μmol/g），并且這種差別有統計學意義（P<0.01)。

圖2 成骨細胞ATP水平的檢測結果（*代表P<0.05）

2.3 成骨細胞的ROS含量檢測結果 檢測實驗組和對照組成骨細胞ROS 含量的結果顯示（如圖3），依普黃酮組（276±20）明顯低于對照組（427±35），有高度顯著性差異（P<0.01)。

圖3 成骨細胞ROS含量的檢測結果（*代表P<0.05）

2.4 成骨細胞UCP2 的mRNA 基因表達水平圖4 顯示的是成骨細胞UCP2 的mRNA 基因表達情況，與對照組（0.68±0.05）相比，依普黃酮組（0.84±0.08）出現了顯著的升高，P<0.05。

圖4 成骨細胞UCP2的mRNA的基因表達水平（*代表P<0.05）

2.5 成骨細胞UCP2 的蛋白表達水平UCP2蛋白檢測結果顯示，依普黃酮組較高（0.51±0.04），對照組較低（0.39±0.03），兩組之間的差異具有統計學上的意義（P<0.05），見圖5。

圖5 成骨細胞UCP2蛋白水平表達的檢測結果（*代表P<0.05）

3.討論

近年來，人們越來越關注骨質疏松癥對口腔醫學的影響，如種植體植入后的骨整合，拔牙后牙槽骨的骨吸收，或牙周炎的骨改變等[13-16]。依普黃酮作為一種有效的防治骨質疏松的藥物，在多個國家得到了廣泛的應用。其不但可以抑制骨吸收，并且具有雌激素和降鈣素的作用。依普黃酮可能在GPER1 的p38MAPK 信號通路途徑中發揮重要的作用[17]。因此，依普黃酮對頜骨以及口腔疾病的影響也越來越受到學者的關注，對于其相關的分子機制研究也成為熱點。有研究表明依普黃酮可以增加牙周膜干細胞的成骨分化，并且GPR30 介導的PI3K/Akt 通路在其中起著重要的作用[8]。p38MAPK 通路和PI3K/Akt 通路均能通過磷酸化某些因子調控著細胞的增殖和凋亡。而磷酸化的過程是在線粒體中完成的。在本研究中，通過體外培養骨質疏松大鼠下頜骨成骨細胞，研究依普黃酮對成骨細胞的線粒體相關細胞因子的影響，也為口腔醫學的進一步研究提供了一定的研究思路。

線粒體是一種重要的細胞器，為細胞功能活動提供能量，有“電力站”之稱，同時，它也是有氧呼吸的重要場所，與ATP 和ROS 的生成直接相關。而UCP2 作為線粒體內膜上的質子轉運蛋白，使質子通過直接滲漏回線粒體基質的方式，部分解偶聯氧化磷酸化，使得ATP的產生出現減少的情況[18，19]；同時，UCP2 通過減少呼吸鏈電子漏的發生和降低線粒體內膜兩側的電化學梯度，能減少ROS 的產生。對于ATP 來說，Megha Rajendran 等認為，ATP 不僅是細胞進行各種功能活動能量的直接來源，也是生物體內外新陳代謝和信號傳導的中心分子[20]。Lukas Jaroslaw 等研究報道UCP2 通過調控ATP 的濃度起到調控細胞鈣的攝取[21]；而鈣離子在細胞行使功能活動時起到重要的作用。同時，對于ROS 來說，ROS 是衰老、炎癥及某些疾病的發病機制之一，可以通過氧化應激反應誘導細胞凋亡，從而起到調節機體細胞生死平衡的作用。已有多個研究表明，當線粒體內膜電勢升高時，UCP2可抑制ROS 的產生[22，23]。而在口腔醫學研究中，也有學者研究發現炎癥微環境可以顯著地提高牙周膜干細胞的ROS表達水平，從而起到抑制細胞線粒體生成和抗氧化反應[24]。Fatokun AA 等[25]的研究也表明，ROS 起到影響成骨樣細胞作用，從而推測其可能與骨質疏松癥有一定得關系。所以說，線粒體相關因子UCP2、ATP和ROS三者既關系密切，又各自在細胞的各種功能活動中起著重要的作用，從而為依普黃酮對骨質疏松癥頜骨成骨細胞影響的分子機制的探討，提供一種好的研究思路和途徑。

已經有學者研究發現，去勢后大鼠脂肪組織中UCP2的表達出現了降低[26]。并且我們前期的研究結果顯示，骨質疏松大鼠下頜骨成骨細胞表達UCP2 較低，而ROS 和ATP 較高[10]。在本實驗中，研究發現依普黃酮能促進UCP2 的表達，降低ROS的表達，部分糾正了骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的異常表達，通過降低ROS對成骨細胞的結構和功能具有保護作用，也提示依普黃酮可能通過UCP2 和ROS 來調節骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的功能活動。然而，本實驗還表明，依普黃酮對成骨細胞的作用，除了ROS 的減少和UCP2 的增加，ATP 的產生也增加，這似乎是使得骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞本來就很高的ATP 的表達更高了，但是，其一方面表明ATP的產生可能不僅僅受UCP2的調控，其他基因或蛋白質也可能對ATP 的產生起調控作用，另一個方面也說明依普黃酮通過增加ATP 水平為成骨細胞的各種功能活動提供足夠的能量支持，促進骨生成，從而起到一定的防治骨質疏松的作用。

總之，依普黃酮可能起到調控骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞的線粒體相關因子UCP2、ROS 和ATP等的作用，但是其作用機制的研究非常復雜，我們的研究結果只是提供了一定的研究基礎和理論依據，仍然需要進一步開展更多的實驗研究來探索。