賈氏銀柴退熱湯提取工藝的優(yōu)化

譚麗媛，翟康欣，遆安航，李思思，劉 瑞，郭愛玲，張淑蓉

（山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，山西 晉中 030600）

急性上呼吸道感染是常見疾病，全年都可發(fā)生，由病毒和細(xì)菌引起，由于感冒的致病原主要是病毒，而且其種類繁多，目前尚未找到理想的具有特殊療效的疫苗和藥物，仍處于對癥治療階段［1-3]。賈六金主任醫(yī)師是首屆全國名中醫(yī)，從事中醫(yī)兒科臨床及教學(xué)四十余載，擅長治療兒科呼吸系統(tǒng)疾病，他自創(chuàng)的賈氏銀柴退熱湯由金銀花、連翹、柴胡、黃芩等藥材組成，具有辛涼解表、清熱解毒、利咽透邪之功效，主治小兒急性上呼吸道感染等疾病［4-6]，為銀翹散和小柴胡湯加減組合而成，通過適當(dāng)?shù)呐湮榭蛇_(dá)到標(biāo)本兼治的效果，療效肯定，用藥易得，南北通用，真正做到了價(jià)廉效驗(yàn)，具有廣泛的應(yīng)用和開發(fā)前景［7-13]。

提取工藝作為復(fù)方中藥制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，將直接影響其質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化賈氏銀柴退熱湯提取工藝，以期為該制劑后期開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 高效液相色譜儀，配置Waters 2998 檢測器、Empower 工作站（美國Waters 公司）；AE240 電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；FA2104 電子天平（萬分之一，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；H66MC 超聲波清洗機(jī)（無錫超聲電子設(shè)備公司）。

1.2 試劑與藥物 黃芩、柴胡、金銀花等藥材購于安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司、河北全泰藥業(yè)有限公司、亳州市遠(yuǎn)光中藥飲片廠、安徽盛堂中藥飲片有限公司，連翹采自山西晉中（蒸制30 min 后在60 ℃以下烘干），所有藥材經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室裴香萍副教授鑒定為2015 年版《中國藥典》 收載品種。綠原酸（批號 110753-201716）、黃芩苷（批號110842-201508）對照品購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純（批號12960217，瑞典歐森巴克化學(xué)公司）；甲酸為色譜純（批號20141021，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；甲醇為分析純（批號20140110，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸、黃芩苷含量測定

2.1.1 色譜條件 BDS HYPERSIL C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫室溫；檢測波長330 nm。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品綠原酸1.90 mg、黃芩苷2.30 mg，甲醇定容至10 mL 量瓶中，搖勻，即得（每1 mL 分別含2 種成分0.38、0.46 mg）。

2.1.3 供試品溶液制備 按照處方比例取金銀花、柴胡、連翹等藥材，蒸餾提取揮發(fā)油，蒸餾后水溶液用另外容器收集，藥渣與板藍(lán)根等其余藥材加12 倍量水煎煮2 次，每次1 h，合并煎液與水溶液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.15～1.20（80 ℃），60 ℃下干燥。精密稱取湯劑提取物0.5 g，置于密塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W、頻率45 kHz）提取40 min，取出，放冷，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 按方劑處方和工藝，分別制備缺金銀花、缺黃芩的陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分峰形對稱，分離度良好，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.1.6 方法學(xué)考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得到回歸方程分別為綠原酸Y=125 858X+3 519.2（r=0.999 9）、黃芩苷Y=487 976X+13 907（r=0.999 8），分別在0.04～0.38、0.05～0.46 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（12 h）試驗(yàn)中綠原酸、黃芩苷峰面積RSD 均小于3%，表明儀器精密度、方法重復(fù)性、溶液12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好；綠原酸、黃芩苷平均加樣回收率分別為105.06%、107.24%，RSD 分別為1.55%、2.12%。

2.2 單因素試驗(yàn) 以綠原酸、黃芩苷轉(zhuǎn)移率的加權(quán)值（Y）為評價(jià)指標(biāo)（Y=綠原酸轉(zhuǎn)移率×50% +黃芩苷轉(zhuǎn)移率×50%），對浸泡時(shí)間（30、45、60、90、120 min）和煎煮時(shí)間（30、45、60、90、120 min）進(jìn)行考察，結(jié)果見圖2。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面法 以煎煮時(shí)間（A）、煎煮次數(shù)（B）、加水量（C）為影響因素，“2.2”項(xiàng)下加權(quán)值（Y）為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平15 組試驗(yàn)，因素水平見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4。由此可知，因素B 有極顯著影響（P ＜0.01），而因素A、C 無顯著影響（P ＞0.05）；B2有極顯著影響（P＜0.01），而因素A2、C2無顯著影響（P ＞0.05）；因素AB、AC、BC 無顯著影響（P ＞0.05）。回歸方程為Y=38.26+5.96B-8.26B2，相關(guān)系數(shù)R2=0.964 4，表明擬合情況良好，工藝可行［14-15]；調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2=0.900 4，能解釋90.04%響應(yīng)值的變化，可用于預(yù)測分析。

表2 因素水平

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析

通過Design Expert 軟件對表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析［16-17]，結(jié)果見圖3。圖3a（固定加水量10 倍）直觀顯示，煎煮時(shí)間不變時(shí)隨著煎煮次數(shù)增加，響應(yīng)值先升高后趨于平穩(wěn)，而煎煮次數(shù)不變時(shí)隨著煎煮時(shí)間延長，響應(yīng)值保持平穩(wěn)，即煎煮次數(shù)2 次或3 次時(shí)響應(yīng)值最高，而煎煮時(shí)間對其影響不大；圖3b（固定煎煮時(shí)間90 min）直觀顯示，煎煮次數(shù)不變時(shí)隨著加水量上升，響應(yīng)值緩慢升高，而加水量不變時(shí)隨著煎煮次數(shù)增加，響應(yīng)值先升高后趨于平穩(wěn)，故煎煮次數(shù)2 次或3 次，或加水量為12 倍時(shí)響應(yīng)值最高；圖3c（固定煎煮次數(shù)2 次）直觀顯示，煎煮時(shí)間不變時(shí)隨著加水量上升，響應(yīng)值逐漸升高，而加水量不變時(shí)隨著煎煮時(shí)間延長，響應(yīng)值趨于平穩(wěn)，故加水量12 倍時(shí)響應(yīng)值較高，而煎煮時(shí)間對其影響不大，綜上所述，直觀所得最優(yōu)工藝為煎煮時(shí)間60 min，煎煮次數(shù)2 次，加水量12 倍；軟件所得最優(yōu)工藝為煎煮時(shí)間120 min，煎煮次數(shù)3 次，加水量10倍，2 種方法所得結(jié)果差異較大，需作進(jìn)一步考察。

圖3 各因素響應(yīng)面圖

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 將直觀、軟件所得優(yōu)化工藝參數(shù)各取3 批進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5。由此可知，2 種方法所得結(jié)果無明顯差異，考慮到提取效率、資源成本，最終選擇直觀所得優(yōu)化工藝，即煎煮時(shí)間60 min，煎煮次數(shù)2 次，加水量12 倍。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)針對賈氏銀柴退熱湯中有效成分綠原酸、黃芩苷極性較大的特點(diǎn)，考察了提取溶劑（50%甲醇、75% 甲醇、甲醇、稀乙醇、無水乙醇）、提取方法（超聲、加熱回流）、提取時(shí)間（15、30、45 min）、溶劑用量（25、50、100 mL），最終確定“2.1.3”項(xiàng)下提取條件。

3.2 因素水平確定 中藥成分復(fù)雜，是其具有多種功效或藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。文獻(xiàn)大多以加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、浸泡時(shí)間為優(yōu)化中藥提取工藝的影響因素；課題組前期對浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同浸泡時(shí)間下有效成分轉(zhuǎn)移率無明顯差異，故未列入Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)中；隨著煎煮時(shí)間延長，有效成分轉(zhuǎn)移率呈遞增趨勢，考慮到大生產(chǎn)實(shí)際情況，將其確定為60～120 min。另外，工廠大生產(chǎn)時(shí)不僅要關(guān)注產(chǎn)率，更重要的是能耗及成本問題，結(jié)合文獻(xiàn)可知煎煮次數(shù)一般不超過3次，故本實(shí)驗(yàn)將其確定為1～3 次；賈氏銀柴退熱湯中大多為草、葉等松泡類藥材，加水量過少時(shí)難以浸沒藥材，而過多時(shí)能耗態(tài)大，故將其確定為8～12 倍。