銀杏內酯B 抗腫瘤活性研究進展

朱志斌馮自立 徐佳元陳 旺張宇航董夢堯

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2.秦巴生物資源與生態環境省部共建國家重點實驗室，陜西 漢中 723001；3.陜西理工大學維生素D 生理與應用研究所，陜西 漢中 723001）

銀杏內酯B 是從銀杏葉中分離出的二萜類化合物，質量分數達1.2%以上，是目前有效活性內酯中活性最顯著的成分［1]，具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化、抗休克、清除自由基等多種藥理活性［2-4]，具有保護腦缺血損傷、擴張冠脈血管、增強心肌收縮力、治療老年癡呆等作用［5-9]，近年來研究發現它還可抗腫瘤［10]，逐漸受到國內外學者的關注。

銀杏內酯B 對許多腫瘤細胞內、外都具有調節作用，通過NF-κB、MAPK、PI3K-AKT、ERK、mTOR 等途徑抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。該成分被譽為天然的血小板活化因子受體（PAFR）拮抗劑，是治療腫瘤細胞的關鍵調節因子，可與細胞受體和蛋白質結合，調控相關基因，改變細胞周期，抑制致癌物質及相關通路，阻止腫瘤細胞生長和轉移，影響自噬來發揮抗腫瘤作用。

本文綜述了銀杏內酯B 的PAFR 構效關系，著重闡述該成分抗腫瘤活性及潛在作用機制，以期為進一步相關研究提供理論基礎。

1 銀杏內酯B PAFR 構效關系

銀杏內酯B 分子由1 個螺壬烷（A 環與B 環）、1 個四氫呋喃環（D 環）、3 個內酯環（C 環、E 環與F 環）組成的剛性籠狀十二碳骨架結構，側鏈連接1 個叔丁基團，是一類稀有的天然化合物，構效關系見圖1。銀杏內酯B 獨特的結構使其難溶于水，不易被生物體利用，發揮其應有藥效，由此國內外學者對其C1-OH 位、C3-OH 位、C7-OH位、C10-OH 位、C 環、F 環及其他環系進行醚化、酯化、鹵化、重氮化、氨基化、糖基化等，發現對C1、C10位引入大的芳香類基團、叔丁基基團時能得到活性更優的PAFR拮抗劑，其中引入吡啶環后衍生物拮抗性是銀杏內酯B 的10.5 倍，同時C 環、D 環、F 環對活性也有很大影響，這些衍生物的合成改變了銀杏內酯B 的結構，提高了該成分水溶性，有利于生物體吸收和發揮藥效，并增加其拮抗PAFR 活性［11-12]。

圖1 銀杏內酯B PAFR 拮抗作用的構效關系

2 銀杏內酯B 抗腫瘤機理

2.1 卵巢癌 卵巢癌是全球女性第五大癌癥，也是婦科死亡率最高的疾病，分為I 型、Ⅱ型腫瘤［13]，前者發病模式包含 KRAS（V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog）、BRAF 等基因突變，以及罕見TP53（Tumor protein p53）突變、PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten）和 PIK3CA（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase，catalytic subunit alpha）信號通路異常、RAS 基因突變等。而后者發病機理包含TP53 突變、癌癥基因CCNE1 擴增等［14-16]。

姜偉等［17]在體內外實驗中發現，銀杏內酯B 可抑制卵巢癌細胞的增殖和裸鼠瘤的增長，抑瘤率達到48%，與順鉑（CDDP）聯合應用可達78.2%，可作為治療卵巢癌的輔助藥物，其機制可能是通過抑制血小板活化因子（PAF）、血小板活化因子受體（PAFR）表達來抑制酪氨酸激酶Src 和p38 絲裂原活蛋白激酶（p38MAPK），使p38MAPK 無法激活下游轉錄因子［18]，其中包括與細胞侵襲密切有關的環磷酸腺苷（cAMP）應答原件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），導致CREB 不能結合到基質金屬蛋白酶 2/9（Matrix metalloproteinase 2/Matrix metalloproteinase 9，MMP2/MMP9）基因上游的啟動子位置，MMP2、MMP9 mMRA 無法表達，從而抑制卵巢癌細胞遷移。除此之外，銀杏內酯B 還上調了25 個具有抗腫瘤作用的蛋白（如p53），下調了22 個與腫瘤遷移有關的蛋白（如β-catenin）。

Jiang 等［19]發現，25～100 μmol/L 銀杏內酯B 處理人卵巢癌細胞SKOV3、CAOV3 后，均能以劑量依賴的方式顯著抑制細胞增殖（P＜0.05）；在100 μmol/L 銀杏內酯B 處理卵巢癌細胞時，對卵巢癌細胞SKOV3 抑瘤率為57.3%，對卵巢癌細胞CAOV3 抑瘤率為63.1%；50 μmol/L 銀杏內酯B 與1 μg/mLCDDP 聯合應用時，卵巢癌SKOV3 細胞增殖下降到64.6%，卵巢癌CAOV3 細胞增殖下降到67.5%，細胞凋亡增加。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳（SDSPAGE）分析總蛋白發現，p21 蛋白、p27 蛋白、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）升高，細胞周期蛋白（cyclin DI）降低。由此可知，銀杏內酯B 可能通過上調p21、p27、caspase-3、caspase-8、下調cyclin DI 來抑制卵巢癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。

Yu 等［20]報道，PAFR 是一種新的有希望治療腫瘤的靶點，順鉑（CDDP）治療卵巢癌使NF-κB/p65 和缺氧誘導因子（HIF-1α）在細胞核內積累，導致PAFR 上調。銀杏內酯B 抑制了PAFR，PI3K 和細胞外調節蛋白激酶（ERK）通路，從而增強了卵巢癌細胞對CDDP 的敏感，通過PAFR 拮抗劑銀杏內酯B、CDDP 共同治療來顯著降低腫瘤生長。

Ye 等［21]調查顯示，長期使用銀杏葉制劑后血漿中可檢測到質量濃度高達8.5 ng/mL 的銀杏內酯A、1.0 ng/mL的銀杏內酯B，卵巢癌發生風險較未使用銀杏葉制劑的女性有所降低。體外研究表明，含10、50、100 μmol/L 銀杏內酯的標準銀杏提取物對卵巢癌細胞OVCA429 具有顯著抑制作用（P ＜0.01），50、100 μmol/L 銀杏內酯A 及10、50、100 μmol/L 銀杏內酯B 對人卵巢癌細胞OVCA429 增殖表現出極顯著影響（P＜0.01），相比對照組降低了約60%，與標準銀杏葉提取物的作用相當，在其他非黏液性卵巢癌細胞系（如OVCA420、OVCA433）中也觀察到了類似的抗增殖作用，銀杏內酯A、銀杏內酯B 對卵巢癌細胞增殖的抑制率約為30%～40%。分析銀杏內酯對漿液型卵巢癌細胞OVCA429 的細胞周期和DNA 分布的影響發現，銀杏內酯B（100 μmol/L）處理OVCA429 細胞24 h 后，G0/G1期DNA 水平從47.9% 增加到51.5%，而S 期降至35.8%；100 μmol/L 銀杏內酯B 處理OVCA429 細胞48 h 后，G0/G1期DNA 水平從47.9%增加到65.1%，而S 期降至24%；銀杏內酯A 處理OVCA429 細胞48 h 后，G0/G1期DNA 水平從50.7% 顯著增加到86.1%，而S 期從36.5% 減少到10.3%。由此推測，銀杏內酯A、銀杏內酯B 抑制卵巢癌細胞增殖可能與細胞周期中的G1至S 期阻滯有關。

2.2 乳腺癌 銀杏內酯B 能高度抑制人乳腺癌的增殖［22]。Chan 等［23]發現，5～80 μmol/L 銀杏內酯B 處理人乳腺癌MCF-7 細胞24 h 后，以劑量依賴性的方式對其增殖具有明顯抑制作用。其機制可能是銀杏內酯B 誘導乳腺癌細胞MCF-7 中活性氧的產生，使細胞質基質中游離的Ca2+、一氧化氮（NO）水平增加，線粒體膜電位（MMP）降低，caspase-9、caspase-3 蛋白表達激活，p53 基因、p21 基因mRNA 表達提高，從而促進乳腺癌細胞的凋亡。

Papadopoulos 等［24]體內外實驗發現，銀杏內酯B 通過控制外周型苯二氮卓受體（Peripheral benzodiazepine receptor，PBR）表達來控制腫瘤生長。在高度侵襲性、富含PBR 的人乳腺癌細胞系MDA-231 中，銀杏內酯B 以時間和劑量依賴性方式降低PBR 表達和細胞增殖；在體內模型中，進一步驗證了該成分顯著抑制裸鼠體內MDA-231 細胞移植物的細胞核中PBR 表達和生長（P＜0.01）。

2.3 結直腸癌 結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是一種受染色體異常和基因突變的胃腸道惡性腫瘤，死亡率居高。楊彬等［25]用不同質量濃度（1、5、25 mg/mL）銀杏內酯B 處理人CRC 細胞系HCT116 72 h，發現該成分以劑量依賴性的方式顯著提高人CRC 細胞系HCT116 的增殖抑制率（P＜0.01）、細胞凋亡率（P＜0.01），前者在25 mg/mL下的細胞凋亡率為47.8%，與對照組相比有顯著性差異（P＜0.01），其機理可能是降低抗凋亡蛋白Bcl-2 基因表達，升高促凋亡蛋白Bax 活性，抑制線粒體融合蛋白1（Mfn1）表達，從而促進結直腸癌細胞的凋亡及裸鼠瘤的增長。

Sun 等［26]報道，銀杏內酯B 通過對PAF 的抑制作用可顯著抑制結腸炎，并減少了氮氧甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的CAC 中的腫瘤數量和負荷，可能與銀杏內酯上調血清血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）活性，降低腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL-1β、IL-6）表達，降低腫瘤細胞中血管內皮生長因子（VEGF）、微血管密度（MVD）表達有關，因此，PAFR 拮抗劑可能是新穎的CAC 治療策略。

2.4 膀胱癌 膀胱癌始于膀胱移行上皮，會在膀胱外積聚并擴散到附近淋巴結或其它部位，這一侵襲特征揭示了其侵襲性調控的基本機制。鋅指轉錄因子（ZEB1）基因的表達量與腫瘤的侵襲與轉移有密切地關系，銀杏內酯B 可劑量依賴性地降低膀胱癌細胞ZEB1 基因的表達，從而抑制膀胱癌細胞的侵襲。Zhi 等［27]用不同濃度（0.5、1、2 nmol/L）銀杏內酯B 處理人膀胱癌細胞系24 h，發現該成分劑量依賴性地降低膀胱癌細胞中ZEB1 蛋白，但不降低mRNA 水平，在翻譯水平上調節ZEB1，其機制可能是銀杏內酯B 通過產生大量miR-223-3p 來與ZEB1 mRNA 的3′-UTR 結合，阻止翻譯ZEB1 蛋白，降低膀胱癌細胞擴散，從而抑制膀胱癌細胞的增殖。

Kispert 等［28]發現，香煙煙霧提取物（CSE）暴露于膀胱癌細胞后可使PAF 積累，PAFR 過表達，促進細胞的跨內皮遷移，增加膀胱癌細胞與膀胱內皮細胞的粘附，促進膀胱癌細胞轉移，而銀杏內酯B 可以消除這種作用。因此，PAF-PAFR 相互作用的靶向性可以作為一個有益的治療靶點，用于抑制膀胱癌細胞的侵襲。

2.5 肝癌 Chan 等［29]用不同濃度的的銀杏內酯B 處理乙醇誘導的人肝癌細胞HepG2，發現低劑量（5～25 μmol/L）銀杏內酯B 可抑制乙醇誘導肝癌細胞的凋亡，而高劑量（50～100 μmol/L）下以劑量依賴性方式增強了乙醇誘導肝癌細胞凋亡，其機制可能是高劑量銀杏內酯B 通過增強活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產生、激活氨基末端激酶（JNK）和caspase-3 信號、DNA 片段化去促進肝癌細胞凋亡。因此，銀杏內酯B 具有抑制肝癌細胞增殖和促進肝癌細胞凋亡的能力。

Ghosh 等［30]用載有銀杏內酯B 的聚合物納米膠囊處理二乙基亞硝胺（DEN）誘導的大鼠肝癌，發現未涂層的GB聚合物納米膠囊具有一定的預防肝癌細胞的能力，可能是納米膠囊表面正電位使更高的GB 在肝細胞內蓄積，尤其是在電子致密的細胞器線粒體中積累。另外，銀杏內酯B調控活性氧、p53、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21、NF-κB、誘導型一氧化氮合酶、環氧化酶-2（COX-2）、VEGF 表達來保護線粒體免受二乙基亞硝胺引起的氧化損傷，從而預防肝癌細胞（Hepatocellular carcinoma，HCC），反映出抗癌潛力。

2.6 胰腺癌 胰腺癌是一種致死性極強的疾病，其特征是間質濃密，血管形成不足，很難被許多藥物和免疫系統穿透，存活率極低。Lou 等［31]報道，500 μmol/L 以下銀杏內酯B 對胰腺癌細胞無明顯的細胞毒性，而與吉西他濱聯用時可增強了細胞對后者的敏感性，抑制細胞的增殖，從而促進其凋亡，其機制可能是銀杏內酯B 可抑制PAFR 表達，顯著降低NF-κB/p65 磷酸化，抑制了NF-κB 活性，增加了胰腺癌細胞系BxPC-3、CAPAN1 對吉西他濱的敏感性，促進胰腺癌細胞凋亡。

2.7 前列腺癌 前列腺癌（prostate cancer，PCA）是導致癌癥死亡的第二大主要原因，也是男性中最常見的癌癥。Yao 等［32]指出，PAFR 可促進腫瘤發生、血管生成、轉移，有望作為抑制前列腺癌的新靶標。用銀杏內酯B 處理前列腺癌細胞PC3、LNCaP 后，可提高其對電離輻射的敏感性，增強殺傷作用，減輕腫瘤負擔，其機制可能是該成分通過阻斷PC3、LNCaP 細胞內PAFR/Beclin 1 復合物的形成來激活絲氨酸磷酸化功能，使放射后PAFR 表達增加，從而起到增敏作用。

Ji 等［33]研究表明，PAFR 能激活ERK 1/2 通路，進而增加MMP-3 的表達，降低鈣粘附蛋白E（E-cadherin）的表達，最終促進前列腺癌細胞的生長、侵襲和轉移。因此，PAFR 可能成為前列腺癌治療的潛在靶點，為治療前列腺癌提供新策略。

2.8 肺癌 非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的一大類，其風險和轉移是由多種異常的分子改變引起的，包括KRAS、PI3K、Akt 或Raf 癌蛋白的突變激活及抑癌基因（PTEN 和TP53）的失活［34]。研究表明，PAFR 是G 蛋白偶聯受體（GPCR）之一，PAR 激活PAF/PAFR 信號軸，啟動PAFR 與信號轉綠激活因子（STAT3）之間的前反饋回路，促進人非小細胞肺癌細胞惡性轉移，可通過上調G 蛋白依賴的酪氨酸激酶Src 或JAK 2激酶的活性來增強白細胞介素-6（IL-6）表達，從而激活STAT3，刺激上皮間充質轉化（EMT），驅動NSCLC 的惡性進程［35]。而且，特異性PAFR 拮抗劑可能是抑制NSCLC侵襲的新靶點。

Coyne 等［36]報道，50 μmol/L 銀杏內酯B 對肺腺癌細胞（A549）的最大殺傷力僅為5.3%。而與地塞米松聯合配伍后最大抑瘤率達到58.6%。

趙林等［37]發現，銀杏注射液可有效緩解肺癌患者的血液高凝狀態（P＜0.05），并且與其他臨床藥物相比不容易出現出血等不良反應。其中GB 作為PAFR 拮抗劑發揮了主要作用。

2.9 抗食管鱗狀細胞癌 食管鱗狀細胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在我國發病率較高，其致病機理尚不清晰。Chen等［38]研究顯示，PAFR 作為一種G 蛋白偶聯受體在ESCC細胞中表達量增加，促進體內外ESCC 的惡性發展，而PAFR 的耗竭則抑制了這些效應，其機制可能是PAFR 通過上調FAK（Focal Adhesion Kinase）激酶活性，激活PI3K/AKT（Phosphatidylinositol 3-kinase/AKT）、AKT 觸發核因子NF-κB 轉錄來激活PAFR 表達，PAFR 和AKT 之間的這種相互正向調節促進了ESCC 細胞侵襲性。因此，天然PAFR拮抗劑銀杏內酯B 有望成為治療食管鱗狀細胞癌的靶向抑制劑。

2.10 黑色素瘤 黑色素瘤生長、血管生成、轉移的進展受到炎癥性腫瘤微環境的強烈促進，這是由于炎癥細胞、基質細胞分泌大量細胞因子和趨化因子所致。PAF 及其PAFR 被證明是腫瘤細胞與內皮細胞粘附、血管生成、腫瘤生長和轉移的重要調節因子，在轉移性黑色素瘤細胞中它刺激環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB）的磷酸化，并激活轉錄因子1（ATF-1），導致基質金屬蛋白酶2（MMP-2）和膜型1-MMP 的過度表達，促進黑色瘤細胞侵襲。同時，凝血酶通過其受體蛋白酶激活受體-1（Protease activated receptor-1，PAR-1）的活性來調節腫瘤細胞與血小板和內皮細胞的粘附，促進腫瘤血管生成及腫瘤生長和轉移［39-40]，故PAFR 抑制劑有望成為抑制黑色瘤侵襲的特異抑制劑。銀杏內酯B 被譽為高效PAFR 拮抗劑，但該成分治療黑色瘤細胞的作用需作進一步研究。

2.11 胚囊細胞增殖 Hsuuw 等［41]報道，銀杏內酯B 可通過激活JNK（c-Jun N-terminal kinase）、caspase-3、p21-活化蛋白激酶2（p21-activated protein kinase 2，PAK 2）來對小鼠胚胎干細胞和囊胚的增殖起到一定抑制作用，并能誘導小鼠胚胎干細胞凋亡。

3 總結與展望

銀杏內酯B 具有較強的抗腫瘤活性，不僅能有效抑制腫瘤細胞增殖，抑制其侵襲，誘導其凋亡，還可有效提高化療藥物的有效性，降低耐藥發生，增強放療敏感性。多項研究發現，該成分能抑制卵巢癌、乳腺癌、肺癌、結直腸癌、膀胱癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞的生長和增殖，相關靶點和通路較豐富，其機制主要涵蓋干擾細胞周期，誘導細胞凋亡，調控GPCR、COX-2、NF-κB，MAPK，PI3K-AKT、ERK、mTOR 等信號通路，影響活性氧、P53、Bcl-2、cyclin DI、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P21，誘導型一氧化氮合酶和VEGF 表達等方面。越來越多的證據顯示，PAFR 在多種腫瘤細胞轉移中起著重要作用［42-46]，其過表達可誘導血管生長因子，激活PI3K/AKT、STAT3、mTOR、NF-κB 等相關通路，上調MMP2、MMP9 表達及Src、JAK2 激酶、FAK 激酶等活性，從而促進了卵巢癌、非小細胞癌、食管癌、肝癌、黑色瘤等腫瘤的惡性發展，對其拮抗作用，包括清除自由基、抗氧化作用可能是銀杏內酯B 防治腫瘤的關鍵，但其具體作用機制還需要繼續研究探索。

銀杏內酯B 的經典功能是抗血小板聚集，被譽為天然的血小板活化因子受體拮抗劑，主要用于保護腦缺血損傷及神經系統的保護，廣泛應用于治療阿爾茨海默病、哮喘、帕金森綜合癥等，但對其非經典功能抗腫瘤作用鮮有報道。本文對近些年有關銀杏內酯B 抗腫瘤作用的文獻加以綜述，希望有更多研究人員將目光轉向該領域，深度研究該成分相關機制，從而擴大其臨床應用范圍。

截至2013 年5 月，國家食品藥品監督管理總局（SFDA）已經批準了173 個銀杏葉制劑的生產批文，國內相關生產廠家達到一百多家［47]。我國是全球最大的銀杏制品生產國和消費國，已經有多種銀杏葉制劑、銀杏內酯提取物、銀杏內酯B 注射液上市，已成為治療心腦血管疾病的優選天然藥物，并且銀杏類藥品、保健品已有40 多種，其安全性、有效性已得到廣泛認可。臨床上，銀杏類藥物大多為復方制劑，隨著有效藥用成分的明確，銀杏內酯A、B、C 等單一有效成分新藥或混合制劑成為近十年來相繼開發的目標，我國自主研發的銀杏內酯B 注射液在治療腦缺血方面的作用已得到臨床初步證明，有望成為相關藥物的新選擇。

隨著研究的不斷深入，近幾年來也有許多關于銀杏內酯制劑在糖尿病、肝臟疾病、腎病、腫瘤等近20 種疾病方面的報道［48-51]，在已鑒定的12 種天然內酯類化合物中，對抗腫瘤活性研究主要集中在銀杏內酯B 單體，應從豐富內酯單體及多組分多靶點協同作用的角度作進一步研究。目前，對銀杏內酯B 抗腫瘤作用的研究僅處于基礎研究階段，將該成分及其衍生物開發為抗腫瘤藥物還需要開展大量的基礎研究和應用研究，具有廣闊的前景。