地黃多糖對東莨菪堿誘導小鼠學習記憶能力障礙的改善作用及其機制

2021-06-26 14:09:56馬媛媛姚曉英談卓臣廖茂行

中成藥 2021年6期

馬媛媛，姚曉英，談卓臣，廖茂行

（上海市公共衛生臨床中心，上海 201508）

學習記憶障礙是指近期記憶不能轉入長時記憶及對以往儲存的信息提取困難的癥狀，為中樞神經系統疾病［1]，隨著人口的老齡化其發病比例不斷增加，對老年人的影響日益嚴重。學習記憶障礙的發病機制復雜，現有的治療藥物主要包括抗氧化劑、自由基清除劑、腦代謝調節劑、減緩谷氨酸傳遞及改善膽堿能神經系統類藥物，但效果難以讓人滿意［2]。中藥及其復方制劑不良反應小，對疾病的多個途徑、多個靶點均有干預作用，并對學習記憶障礙的治療具有較大優勢［3]。

地黃應用歷史悠久，具有抗老年癡呆、治療糖尿病、補血、滋陰等諸多藥理作用，環烯醚萜苷類、糖類等是其主要活性成分［4]。研究發現，地黃中的寡糖成分可以改善癡呆大鼠的學習記憶能力，其機制與減少神經元凋亡、降低氧化應激水平及提高乙酰膽堿含量有關［5-6]，而多糖成分具有抗氧化、調節血糖和血脂、增強免疫功能、促進造血功能、抗腫瘤及促進間充質干細胞增殖等作用［7]。但目前尚未發現地黃多糖提高學習記憶能力方面的報道，故本實驗擬研究該成分是否具有改善東莨菪堿誘導的小鼠學習記憶能力障礙作用，并初步探討分子機制，為其進一步應用奠定基礎。

1 材料

1.1 動物 SPF 級昆明種小鼠80 只，雄性，體質量18～22 g，由菲諾克生物科技（上海）有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2018-0005。

1.2 試劑與藥物地黃多糖為淡黃色粉末，經苯酚硫酸法測定總糖質量分數在90% 以上，由陜西慈緣生物技術有限公司提供（批號20190126）。多奈哌齊（陜西方舟制藥有限公司，批號20190224）；氫溴酸東莨菪堿（上海晶純生化科技股份有限公司）；乙酰膽堿轉移酶（ChAT）、乙酰膽堿酯酶（AChE）活性檢測試劑盒（批號20190518、20190615，泉州市九邦生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）水平檢測試劑盒（批號S0109、S0051、S0131M，上海碧云天生物技術有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）水平檢測試劑盒（批號H052、H002，南京建成生物工程研究所）；兔源核因子κB p65（NF-κB p65）、NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）及 β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號ab16502、ab7217、ab8227，英國Abcam 公司）；辣根酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號C020208，洛陽佰奧通實驗材料中心有限公司）。

1.3 儀器 ML104/02 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Spectra Max M5 型多功能酶標儀（美國MD 公司）；低溫高速多功能離心機（德國Eppendorf 公司）；小型垂直蛋白電泳儀（美國伯樂公司）。

2 方法

2.1 分組、給藥與建模 80 只小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥多奈哌齊組（3 mg/kg）及地黃多糖高（30 mg/kg）、低（15 mg/kg）劑量組，每組16 只，適應性飼養1 周后開始給藥。正常組及模型組小鼠灌胃同體積的生理鹽水，連續28 d。自第24 天開始，于灌胃給藥結束30 min 后正常組小鼠腹腔注射生理鹽水0.2 mL，其余各組均腹腔注射3 mg/kg 氫溴酸東莨菪堿，連續5 d。

2.2 Morris 水迷宮實驗末次注射氫溴酸東莨菪堿后30 min，通過Morris 水迷宮實驗開展學習能力和記憶能力測試。安全平臺位于第Ⅲ象限中央，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限的中央處將小鼠放入水池，每次訓練時間90 s，每天3 次，連續5 d。如果小鼠找到安全平臺時間少于90 s，則記錄實際尋找平臺所需時間，即為逃避潛伏期；如果找到安全平臺時間大于90 s，則需將其引致安全平臺，逃避潛伏期記為90 s。空間探索實驗在逃避潛伏期實驗完成后開始，于第Ⅰ象限的中央處將小鼠放入水池，觀察90 s 內在第Ⅲ象限路程百分比、第Ⅲ象限的停留時間、首次穿越平臺時間、穿越平臺次數。

2.3 海馬組織神經遞質、氧化應激及炎癥指標檢測 Morris 水迷宮實驗完成后，各組隨機取8 只小鼠，頸椎脫臼法處死，無菌操作分離腦組織，快速分離海馬，加入預冷的生理鹽水制備10% 組織勻漿液，12 000 r/min 離心10 min。用微量移液器槍頭小心吸取上清液，在-80 ℃冰箱中保存備用。采用酶聯免疫吸附法，參照試劑盒操作步驟檢測海馬組織 ChAT、AChE、SOD、CAT 活性及 MDA、TNF-α、IL-1β 水平。

2.4 蛋白免疫印跡實驗 Morris 水迷宮實驗后各組取剩余8 只小鼠，頸椎脫臼法處死，無菌操作分離腦組織，快速分離海馬置于研缽中，緩慢加入液氮并研磨，再加入組織裂解液，裂解30 min 后12 000 r/min 離心10 min，微量移液器槍頭小心吸取上清液，BCA 法檢測蛋白表達。在70 V 恒壓電泳下用10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，手術刀片切取目的條帶，在300 mA 電流下將分離的蛋白轉至聚氯乙烯膜上，常溫下脫脂奶粉封閉1.5 h，漂洗后加入NF-κB p65、IκB-α 及β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜，漂洗后再加入HRP標記的二抗，繼續孵育1.5 h，化學發光法顯色曝光，ImageJ 1.8.0 軟件分析蛋白灰度值，計算NFκB p65 及IκB-α 蛋白相對表達量。

2.5 統計學分析通過SPSS 20.0 軟件進行處理，結果以（）表示，組內比較采用one-way ANOVA檢驗，組間比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 地黃多糖對各組小鼠學習能力障礙的影響模型組小鼠從第1 天到第5 天的逃避潛伏期與正常組比較均增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠的逃避潛伏期均有一定程度的降低，其中陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高劑量組從第1 天開始，地黃多糖低劑量組從第2 天開始差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），表明地黃多糖對東莨菪堿誘導的小鼠學習能力障礙具有改善作用。見表1。

表1 地黃多糖對各組小鼠學習能力障礙的影響（，n=16）Tab.1 Effects of RGLPs on learning impairment of mice in various group（，n=16）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 地黃多糖對各組小鼠記憶能力障礙的影響與正常組比較，模型組小鼠在第Ⅲ象限路程百分比、第Ⅲ象限停留時間及穿越平臺次數降低，而首次穿越平臺時間增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠在第Ⅲ象限路程百分比、第Ⅲ象限停留時間及穿越平臺次數增加（P＜0.01），而首次穿越平臺時間降低（P＜0.01）。見表2。

表2 地黃多糖對各組小鼠記憶能力障礙的影響（，n=16）Tab.2 Effects of RGLPs on memory impairment of mice in various group（，n=16）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.3 地黃多糖對各組小鼠海馬組織ChAT 和AChE活性的影響與正常組比較，模型組小鼠海馬組織ChAT 活性減少（P ＜0.01），而AChE 活性增加（P＜0.01）；陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠海馬組織ChAT 活性增加，而AChE 活性減少，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 地黃多糖對各組小鼠海馬組織ChAT、AChE 活性的影響（，n=8）Tab.3 Effects of RGLPs on ChAT and AChE activities in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 地黃多糖對各組小鼠海馬組織SOD、CAT 活性及MDA 水平的影響與正常組比較，模型組小鼠海馬組織SOD、CAT 活性減少（P ＜0.01），而MDA 水平增加（P＜0.01）；陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠海馬組織SOD、CAT活性增加，而MDA 水平降低，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 地黃多糖對各組小鼠海馬組織SOD、CAT 活性及MDA 水平的影響（，n=8）Tab.4 Effects of RGLPs on SOD，CAT activities and MDA level in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 地黃多糖對各組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平的影響模型組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平與正常組比較升高（P＜0.01）；陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平降低，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表5。

表5 地黃多糖對各組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平的影響（，n=8）Tab.5 Effects of RGLPs on TNF-α and IL-1β levels in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.6 地黃多糖對各組小鼠海馬組織NF-κB p65 及IκB-α 表達的影響模型組小鼠海馬組織NF-κB p65 表達與正常組比較增加（P＜0.01），而IκB-α表達降低（P＜0.01）；陽性藥多奈哌齊組及地黃多糖高、低劑量組小鼠海馬組織NF-κB p65 表達降低，而IκB-α 表達增加，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖1、表6。

表6 地黃多糖對各組小鼠海馬組織NF-κB p65 及IκB-α表達的影響（，n=8）Tab.6 Effects of RGLPs on NF-κB p65 and IκB-α expressions in hippocampal tissues of mice in various groups（，n=8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖1 各組小鼠海馬組織NF-κB p65、IκB-α 表達Fig.1 NF-κB p65 and IκB-α expressions in hippocampal tissues of mice in various groups

4 討論

在中樞神經系統中，幾乎所有的腦區都受膽堿能神經系統支配，廣泛分布于嗅結節、紋狀體、基底前腦、中腦區、后腦、脊髓等，參與應激反應及學習記憶等重要生理過程［8]。ACh 是膽堿能系統的主要神經遞質，作為與學習記憶最密切相關的神經遞質，其水平高低決定著能力強弱［9]。ChAT 為ACh 的合成酶，可以催化膽堿與乙酰輔酶A 合成ACh；AChE 可以將ACh 分解為膽堿和乙酸，降低ACh 水平，ChAT 與AChE 的活性共同決定著其水平［10]。本實驗發現，地黃多糖干預后東莨菪堿誘導的模型小鼠海馬組織ChAT 活性增加，而AChE活性減少，表明調節膽堿能神經系統功能是地黃多糖改善模型小鼠學習記憶能力障礙的潛在原因。

神經組織結構獨特，更容易遭受氧自由基的攻擊，破壞DNA 等大分子結構，誘導神經細胞凋亡和死亡，導致學習記憶能力障礙［11]。研究發現，患者體內抗氧化能力下降、自由基堆積，是造成神經細胞毒性的重要原因，進而影響學習記憶功能［12]。SOD 是體內重要的抗氧化酶，在學習記憶能力障礙患者體內其活性下降，自由基大量產生，引起腦組織功能受損［13]。CAT 可降低H2O2的濃度，從而有效緩解學習記憶能力障礙的發生與進展［11]。MDA 可反映機體受自由基影響的程度，其本身也具有毒性，會導致學習記憶能力障礙患者神經元細胞變性、凋亡及壞死［14]。本實驗發現，地黃多糖干預后東莨菪堿誘導的模型小鼠海馬組織SOD、CAT 活性增加，而MDA 水平減少，表明抗氧化應激是地黃多糖改善模型小鼠學習記憶能力障礙的潛在機制。

炎癥反應在東莨菪堿誘導的小鼠學習記憶障礙過程中占有重要地位，在學習記憶能力障礙患者體內TNF-α、IL-1β 水平升高［15]。研究發現［16]，益智護腦方可以通過降低昆明小鼠海馬組織中的TNF-α 及IL-1β 水平，緩解東莨菪堿所致記憶功能障礙。右美托咪定保護東莨菪堿導致的老年大鼠認知功能障礙作用，也與減輕了炎癥因子TNF-α、IL-1β 水平有關［17]；本研究發現，地黃多糖組小鼠海馬組織TNF-α 及IL-1β 水平降低，表明抑制炎癥反應與地黃多糖改善模型小鼠學習記憶能力障礙作用密切相關。NF-κB 廣泛存在于體內所有細胞中，可調節神經細胞炎癥因子表達及活化，參與炎癥過程、神經元可塑性、機體免疫及學習記憶等多種生理、病理過程［18]，當機體受到外界刺激時被激活，促進下游炎癥因子TNF-α 及IL-1β 水平的增加［19]。IκB-α 是NF-κB 的上游信號誘導物，為NF-κB 的重要抑制因子，其表達量增加有助于抑制炎癥反應，緩解學習記憶能力障礙癥狀［20]。本研究發現，地黃多糖組小鼠海馬組織NF-κB p65 表達降低，而IκB-α 表達增加，進一步表明地黃多糖可以下調NF-κB 信號通路的活化水平進而抑制炎癥反應。

綜上所述，地黃多糖可有效改善東莨菪堿誘導的小鼠學習記憶能力障礙，該作用與調節膽堿能神經系統功能、抗氧化應激及抑制炎癥反應有關。