黨參多糖對潰瘍性結腸炎大鼠結腸上皮NF-κB 信號通路的影響

劉雪楓喬 婧高建德 陳正君劉 雄*

（1.甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藏藥化學與質量研究省級重點實驗室，甘肅蘭州 730000；3.甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種多因素導致的原因不明的慢性炎性腸病之一，以腹瀉、腹痛、血便為主要臨床癥狀，近年來發病率明顯升高、發病人群趨于年輕化［1-2]，是世界衛生組織公認的難治性疾病之一，易反復發作［3]。目前常用治療藥物包括水楊酸類、皮質激素類、免疫抑制劑等，但均不能根治UC 的發作，且不良反應較多。近年來，中藥以多靶點、多組分的特點，已成為UC 的重要治療藥物。

黨參為桔梗科黨參 Codonopsis pilosula（Franeh.）Nannf.、素花黨參 Codonopsis pilosula Nannf.Var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，主要有效成分為黨參皂苷、黨參多糖等，具有補中益氣、健脾益肺的功效，臨床上常用于治療脾肺氣虛、咳嗽虛喘、內熱消渴等癥［4]，相關方劑廣泛應用于發作期、緩解期潰瘍性結腸炎的治療［5]。研究表明，黨參多糖具有明顯的抗氧化、免疫調節作用［6]。本實驗探討黨參多糖對潰瘍性結腸炎大鼠的保護作用，并通過NF-κB 信號通路探討其可能作用機制，為該成分利用提供一定理論依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Wistar 大鼠50 只，體質量（220±10）g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供，動物合格證號NO.62001000000208，使用許可證號SYXK（甘）2015-0005，在溫度22～24 ℃、相對濕度40%～60%下以普通飼料喂養。

1.2 試劑與藥物 黨參購于蘭州復興厚中藥飲片有限公司，批號20180319，經甘肅中醫藥大學王明偉副教授鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的根。柳氮磺胺吡啶（SASP，上海信誼天平制藥廠，批號180625）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，天津大茂化學試劑廠，批號180402）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20180514、20180522）；白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯免疫法（ELISA）檢測試劑盒（江蘇酶免生物科技公司，批號分別為0190R2、0195R2、0180R2）；RNA 提取試劑盒、cDNA 反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 檢測試劑盒（德國Qiagen 公司，批號分別為157042224、160017598、157056248）；小鼠SP試劑盒、兔SP試劑盒、DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋科技有限公司，批號分別為SP-9002、SP-9001、ZLI-9018）；NFκB 一抗（美國Genetex 公司，批號GTX107678）；IL-6、IL-10、TNF-α 引物序列均由上海生工生物公司合成，見表1。水合氯醛（鄭州市德眾化學試劑廠，批號181204505）；多聚甲醛、中性樹膠、伊紅、蘇木素（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為G7301、G8590、G070、G080）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 儀器 Primo 高速離心機（德國Heraeus 公司）；5424R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；KD-BM 包埋機（浙江省金華市科迪儀器有限公司）；切片機（德國徠卡公司）；iMark 酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；NanoDrop 核酸濃度測量儀（美國Thermo 公司）；DM7500 實時定量PCR 儀（美國Agilent 公司）；ImageQuant 400 凝膠成像系統（英國GE Healthcare 公司）；RX50 顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）；AE-240 電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

2 方法

2.1 藥物制備 取粉碎藥材500 g，加3 倍體積石油醚回流脫脂2 次，加入3 倍體積95%乙醇，回流提取6 h，棄去提取液，重復3 次，濾渣60 ℃恒溫干燥，加入蒸餾水，以固液比1∶10 提取3 次，每次1 h，合并提取液，并加入無水乙醇使其含醇量達到80%，低溫靜置24 h，沉淀真空干燥，即得黨參多糖，得率為16.39%。經Savage 法脫蛋白后，以苯酚-硫酸法測得多糖質量分數為90.21%。

2.2 分組、建模及給藥 50 只大鼠適應性喂養后，按體質量隨機分為5 組，每組10 只，分別為正常組，模型組，SASP 陽性對照組（0.3 g/kg）及黨參多糖高、低劑量組（9、3 g/kg，按生藥量計算，為成人臨床劑量的30、10 倍），正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水，其余各組給予相應藥物灌胃，每天1 次，連續5 d。大鼠禁食36 h，水合氯醛麻醉，正常組以生理鹽水灌腸，其余各組均以TNBS/乙醇溶液灌腸，具體方法參考文獻［7]。造模后，連續3 d 監測疾病活動指數（DAI），DAI＞0.5 表明造模成功，繼續給藥21 d。

2.3 一般行為及DAI 評分 給藥期間，觀察大鼠精神狀態、進食情況、毛色光澤、腹瀉、黏液便、血便等一般情況，進行DAI 評分，見表2，計算公式為DAI=（體質量下降評分+糞便性狀評分+大便隱血評分）/3。

表2 DAI 評分Tab.2 DAI scores

2.4 結腸黏膜損傷指數（CMDI）評分 末次給藥30 min 后，大鼠禁食不禁水36 h，水合氯醛麻醉后解剖，取從肛門向上至8 cm 處的結腸組織，縱向剖開，生理鹽水洗凈，平鋪固定觀察結腸黏膜大體形態改變：0 分，無損傷；1 分，輕度充血，水腫，表面光滑，無糜爛或潰瘍；2 分，充血水腫，黏膜粗糙呈顆粒狀，有糜爛或腸粘連；3 分，高度充血水腫，黏膜表面有壞死及潰瘍形成，潰瘍最大縱徑小于1.0 cm，腸壁增厚或表面有壞死及炎癥；4 分，在3 分基礎上潰瘍最大縱徑大于1.0 cm或大鼠死亡。

2.5 蘇木精-伊紅（HE）染色 將1 cm 大鼠結腸組織，PBS 漂洗干凈后4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，常規石蠟包埋切片，HE 染色，光鏡下觀察組織病理學形態變化。

2.6 結腸組織中生化指標檢測 取適量大鼠結腸組織，生理鹽水制成10% 勻漿，離心取上清后，按照試劑盒方法檢測SOD 活性和MDA 水平。

2.7 ELISA 法檢測UC 大鼠結腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α 水平 取適量大鼠結腸組織，加入生理鹽水制成10%勻漿，離心取上清，按照ELISA 試劑盒使用書測定IL-6、IL-10、TNF-α 水平。

2.8 實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法測定IL-6、IL-10、TNF-α mRNA 表達 取適量大鼠結腸組織，加入液氮研磨，按照RNA 提取試劑盒說明書提取RNA，采用多功能酶標儀測定樣品濃度。在PCR 擴增儀上將RNA 逆轉錄為cDNA，之后進行RT-PCR 反應，反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸5 min，共40 個循環。應用2-ΔΔCT方法計算各基因相對表達，重復3 次。

2.9 免疫組化法觀察結腸組織中NF-κB 表達 切取3 mm 大鼠結腸組織，石蠟包埋后切制成5 μm切片，常規脫蠟，梯度70% 乙醇水化，檸檬酸鈉熱修復2 次，3% 過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，山羊血清封閉液封閉30 min，每張切片滴加一抗NF-κB（1∶200），4 ℃冰箱過夜，PBS 沖洗后滴加聚合HRP 標記抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗后DAB 顯色10 min 左右，室溫下蘇木素復染90 s，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各反應25 min，中性樹膠封片。顯微鏡觀察結腸組織中NF-κB 表達情況，Image J 軟件統計蛋白表達量。

2.10 蛋白免疫印跡法（Western blot）測定結腸組織中NF-κB 蛋白表達 取適量大鼠結腸組織，加入適量蛋白裂解液勻漿，3 500 r/min 離心15 min，取上清，BCA 法檢測蛋白濃度，并將其調整為4 μg/μL，加熱變性后-80 ℃保存。在制膠、上樣10 μL、電泳、濕轉法轉膜、5% 脫脂奶粉封閉、一抗4 ℃過夜、二抗孵育1 h 后，加入ECL 化學發光液，立即進行蛋白化學發光并獲取圖像，以β-actin 為內參，Image J 軟件計算灰度值。

2.11 統計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者用LSD 法，不齊者用Games-Howell 法檢驗。 P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 黨參多糖對UC 大鼠一般行為及DAI 評分的影響 造模后，除正常組外，其余大鼠均出現體質量下降、懶動、豎毛、厭食癥狀，有明顯腹瀉，甚至出現便血，DAI 評分升高（P＜0.01）。給藥后，正常組大鼠一般情況良好，自主活動正常，飲食正常，毛色有光澤，無腹瀉便血發生；模型組大鼠出現懶動，豎毛，厭食癥狀，有腹瀉發生，甚至出現便血，體質量降低；黨參多糖高、低劑量組大鼠一般情況較模型組好，毛色有光澤，自主活動增加，腹瀉發生率低于模型組，同時各給藥組DAI 評分下降（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

3.2 黨參多糖對UC 大鼠CMDI 評分的影響 正常組大鼠結腸顏色淡紅，表面光滑，腸壁厚薄適中，黏膜皺襞清晰完整；模型組大鼠腸壁紅腫充血，潰瘍明顯，潰瘍面積較對照組擴大（P＜0.01）；黨參多糖組大鼠亦可見結腸水腫、充血或黏膜粗糙，但較模型組有明顯改善（P＜0.05，P＜0.01）。CMDI評分見表3。

表3 UC 大鼠DAI、CMDI 評分（，n=10）Tab.3 DAI and CMDI scores for UC rats（，n=10）

表3 UC 大鼠DAI、CMDI 評分（，n=10）Tab.3 DAI and CMDI scores for UC rats（，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織形態學的影響圖1 顯示，正常組大鼠染色均勻，細胞核形態正常，腸黏膜及基層清晰可見；與正常組比較，模型組大鼠有大量炎性細胞浸潤，黏膜層損傷嚴重，基層分界線消失；與模型組比較，SASP 組大鼠炎性細胞浸潤減少，黏膜損傷較輕；與模型組比較，黨參多糖組大鼠炎性細胞減少，黏膜層損傷較輕，基層較清晰。

圖1 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織形態學的影響（HE，×200）Fig.1 Effect of CPPs on the colonic histomorphology of UC rats（HE，×200）

3.4 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中SOD 活性和MDA 水平的影響 如表4 所示，與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜組織SOD 活性降低（P ＜0.01），MDA 水平升高（P ＜0.01）；與模型組比較，SASP 組大鼠結腸黏膜組織SOD 活性升高，MDA 水平下降，差異有統計學意義（P ＜0.01）；與模型組比較，黨參多糖組可提高大鼠結腸黏膜中SOD 活性（P＜0.01），降低MDA 水平（P＜0.01），高劑量組效果略優于SASP 組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中SOD 活性、MDA水平的影響（，n=10）Tab.4 Effects of CPPs on colonic SOD activity and MDAlevel of UC rats（，n=10）

表4 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中SOD 活性、MDA水平的影響（，n=10）Tab.4 Effects of CPPs on colonic SOD activity and MDAlevel of UC rats（，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.5 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α 水平的影響如表5 所示，與正常組比較，模型組大鼠結腸組織中IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.01），IL-10 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，SASP 組和黨參多糖高、低劑量組大鼠結腸組織中IL-6、TNF-α 水平降低（P ＜0.05，P ＜0.01），IL-10 水平升高（P＜0.01），高劑量組效果優于SASP 組和黨參多糖低劑量組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表5 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中IL-6、IL-10、TNFα 水平的影響（，n=10）Tab.5 Effects of CPPs on the levels of IL-6，IL-10 and TNF-α in colon tissue of UC rats（，n=10）

表5 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中IL-6、IL-10、TNFα 水平的影響（，n=10）Tab.5 Effects of CPPs on the levels of IL-6，IL-10 and TNF-α in colon tissue of UC rats（，n=10）

注：與正常組比較，** P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α mRNA 表達的影響如表6所示，與正常組比較，模型組大鼠結腸組織IL-6、TNF-α mRNA 表達升高（P ＜0.01），IL-10 mRNA 表達降低（P ＜0.01）；SASP 組較模型組抑制 了IL-6、TNF-α mRNA 表達，提高了IL-10 mRNA 表達（P＜0.05）；給予黨參多糖高、低劑量組干預后，IL-6、TNF-α mRNA 表達較模型組降低（P＜0.01），IL-10 mRNA表達升高（P＜0.01）。

表6 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中IL-6、 IL-10、 TNFα mRNA 表達的影響（，n=10）Tab.6 Effects of CPPs on the mRNA expressions of IL-6，IL-10 and TNF-α in the colon tissue of UC rats（，n=10）

表6 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中IL-6、 IL-10、 TNFα mRNA 表達的影響（，n=10）Tab.6 Effects of CPPs on the mRNA expressions of IL-6，IL-10 and TNF-α in the colon tissue of UC rats（，n=10）

注：與正常組比較，** P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.7 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中NF-κB 表達的影響 如圖2、表7 所示，與正常組比較，模型組大鼠結腸黏膜中NF-кB 表達升高（P ＜0.01），SASP 組較模型組減少（P＜0.05）；與模型組比較，黨參多糖高、低劑量組均能減少NF-кB 表達（P＜0.01），并與給藥劑量呈正相關；黨參多糖高劑量組作用比SASP 組更顯著（P ＜0.01）。如圖3 所示，與正常組比較，模型組大鼠結腸組織中NF-кB p65 蛋白表達升高（P＜0.01）；SASP 組NF-кB p65蛋白表達降低（P＜0.05），黨參多糖高、劑量組抑制了NF-кB p65 蛋白表達，差異均具有統計學意義（P＜0.01），與免疫組化結果一致。

表7 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中NF-κB 蛋白表達的影響（，n=3）Tab.7 Effect of CPPs on the expression of NF-κB protein in the colon tissue of UC rats（，n=3）

表7 黨參多糖對UC 大鼠結腸組織中NF-κB 蛋白表達的影響（，n=3）Tab.7 Effect of CPPs on the expression of NF-κB protein in the colon tissue of UC rats（，n=3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與SASP 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

圖2 各組大鼠結腸組織中NF-κB 蛋白表達（×200）Fig.2 NF-κB protein expressions in rat colon tissue in various groups（×200）

圖3 各組大鼠結腸組織中NF-κB p65 蛋白表達Fig.3 NF-κB p65 protein expressions in rat colon tissue in various groups

4 討論

UC 發病機制是多因素的，包括遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫反應失調、環境等［1]，其病程發展可導致纖維化的形成，甚至出現癌變，因此，尋找UC 的有效治療藥物愈來愈受到關注。中藥因其作用靶點多、安全性高等特點，在臨床治療UC 中體現出了獨特的優勢，裴銀奇等［7]對治療潰瘍性結腸炎的處方進行統計后發現，黨參出現頻次在100 次以上。黨參是傳統的補益中藥，也是甘肅省道地藥材，具有健脾益肺、養血生津之效［8]，黨參多糖是采用水提醇沉法從黨參中提取出的有效部位，可調整微生態失調，促進腸道有益菌的生長增殖并抑制腸道潛在致病菌［9-10]，能顯著緩解葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的結腸炎，且效果明顯優于復方四君子湯［11]。

人類潰瘍性結腸炎結腸黏膜中氧化應激失衡，產生的大量自由基損傷機體自身組織或激活炎癥介質，可使結腸炎癥的損傷加劇［12-13]。MDA 是由自由基引起脂質過氧化反應的終產物，其量與自由基含有量和脂質過氧化程度成正比［14]；SOD 是體內消除超氧陰離子的抗氧化酶系，具有清除自由基、抑制脂質過氧化反應的作用，同時能修復受損細胞［14]。當多種危險因素刺激腸道黏膜時，造成腸道功能失調、機體氧化應激失衡，產生的大量自由基引起脂質過氧化反應，導致機體內MDA 水平的升高，SOD的耗竭；同時大量自由基的產生又會導致炎癥介質的釋放，從而進一步造成結腸組織損傷而發生UC。本實驗發現，黨參多糖能顯著降低UC 大鼠結腸組織中MDA 水平，提高SOD 活性，說明它能抑制脂質過氧化反應的發生，改善結腸黏膜損傷。

腸道炎性細胞因子異常表達是UC 的重要機制之一［15]，而UC 炎癥因子的產生又與TLRs/NF-κB通路有密切關系［16]。核因子κB（NF-κB）是炎癥反應期間被激活的主要轉錄因子之一，當炎癥或免疫反應發生時，NF-κB 從細胞質進入細胞核內，調控炎性細胞因子的表達，包括IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等［17-18]。IL-6 是由單核細胞、巨噬細胞及T細胞分泌的一種輔助型T 細胞（Th）Ⅰ型細胞因子，能夠誘導中性粒細胞的分泌和增殖，是具有廣泛生物活性的促炎細胞因子，能直接介入急性期炎癥損傷過程，在UC 的發病過程中扮演重要角色［19]。TNF-α 是一類由單核巨噬細胞產生的一種肽類物質，能刺激中性粒細胞和單核巨噬細胞等合成IL-1、IL-6、IL-8 等細胞因子，在IL-6 的參與下，還可激活磷脂酶，繼而生成白三烯和氧自由基等［20]。IL-10 又名細胞因子合成抑制因子，能抑制中性粒細胞和自然殺傷細胞產生促炎性細胞因子和趨化因子，抑制IL-6、TNF-α 等的產生［19]。本研究結果顯示，用TNBS 聯合乙醇造模后，模型組大鼠結腸組織中NF-κB 蛋白表達顯著升高，IL-6、TNF-α 水平及mRNA 表達升高，IL-10 水平 及mRNA 表達降低；給予黨參多糖后，NF-κB 蛋白表達明顯降低，IL-6、TNF-α 水平及mRNA 表達下降，而IL-10 水平及mRNA 表達升高。說明黨參多糖能抑制NF-κB 信號通路，減少促炎因子IL-6、TNF-α 的釋放，增加抑炎因子IL-10 的釋放。

綜上所述，黨參多糖對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜具有保護作用，其機制可能抑制NF-κB 信號通路的活化，減少IL-6 和TNF-α 等炎性因子的釋放，并增強IL-10 的抗炎作用有關。