鱉甲煎丸含藥血清抑制肝癌細(xì)胞的miRNA-mRNA 調(diào)控機(jī)制分析

李明芬，潘愛萍，林英輝，陳柳燕，李 屏，楊 利，鄧增富，謝楊益，林洪升*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

肝細(xì)胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是一種高度惡性腫瘤，也是世界上由癌癥引起相關(guān)性死亡的第三個原因［1]。同時，HCC 也是我國癌癥中的第二號殺手［2]，嚴(yán)重威脅國人健康，并造成嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。鱉甲煎丸出自東漢醫(yī)家張仲景所著《金匱要略》，具有抵抗腫瘤、治療纖維化和調(diào)節(jié)人體免疫力等作用［3-4]，其防治原則主要包括清熱涼血解毒、疏肝理氣、活血化瘀、清化濕熱和祛瘀理氣等。但目前關(guān)于鱉甲煎丸治療肝癌的分子機(jī)制研究較少，作用機(jī)制未明。本研究通過制備鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)肝癌細(xì)胞，通過全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析微小RNA（MircoRNA，miRNA）和信使RNA（Messenger RNA，mRNA）表達(dá)譜，構(gòu)建miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)的信號通路，旨在為探索中醫(yī)藥治療肝癌提供新思路和新的靶點。

1 材料

1.1 動物 60 只SPF 級SD 雄性大鼠，體質(zhì)量（201.38±17.57）g，均購于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，使用許可證號SYXK（桂）2013-0005。所有操作都在國家實驗動物使用標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行。

1.2 藥物 鱉甲煎丸購于武漢中聯(lián)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z42020772（批號160400），組方藥材鱉甲膠、阿膠、蜂房（炒）、土鱉蟲（炒）、鼠婦蟲、蜣螂、大黃、桃仁、牡丹皮、射干、黃芩、柴胡、干姜、白芍（炒）、桂枝、葶藶子、石韋、厚樸（姜制）、瞿麥、姜半夏、硝石（精制）、黨參。

1.3 試劑 DMEM 培養(yǎng)基購于Gibco 公司（美國，批號8169175）；胎牛血清購于Gibco 公司（美國，批號1828728）；CCK-8 試劑盒購于同仁公司（日本，批號6972-75-8）；細(xì)胞總RNA 提取試劑盒RNeasy mini Kit 購于Qiagen 公司（德國，批號74104）；兔抗人單克隆PNMT 抗體購于Sigma 公司（德國，批號 SAB1410984）；兔抗人單克隆ST8SIA5 抗體購于Sigma 公司（德國，批號SAB101183）；細(xì)胞周期試劑盒購于索萊寶公司（中國，批號20190514）；細(xì)胞凋亡試劑盒購于索萊寶公司（中國，批號20181219）。

1.4 儀器 Multiskan FC 酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；熒光定量PCR（德國Eppendrof 公司）；RT-PCR 儀（美國 Applied Biosystems 公司）；垂直電泳-轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-Rad 公司）；流式細(xì)胞儀Accuri C6（美國BD 公司）。

2 方法

2.1 鱉甲煎丸含藥血清制備 按成人臨床劑量20倍配制（成人劑量為3 g/60 kg，則大鼠給藥劑量為1 g/kg），生理鹽水配制混懸液，按10 mL/kg 灌胃給藥，每天2 次，連續(xù)3 d，于第4 天給藥2 h后，腹腔注射1% 戊巴比妥鈉1～2 mL 每天麻醉，腹主動脈取血，常溫靜置2 h 后離心分離血清，56 ℃滅活30 min，經(jīng)0.45、0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，置于-20 ℃下保存。

2.2 空白對照血清制備 生理鹽水按10 mL/kg 灌胃，每天2 次，連續(xù)3 d，于第4 天灌胃2 h 后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉1～2 mL 麻醉，腹主動脈取血，常溫靜置2 h 后離心分離血清，56 ℃滅活30 min，經(jīng)0.45、0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，置于-20 ℃下保存。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 受贈于廣西中醫(yī)藥大學(xué)生化教研室，人肝癌細(xì)胞株Huh7購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，人正常肝細(xì)胞L-02 購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 和Huh7 均采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，人正常肝細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37 ℃、5% CO2下靜置貼壁。

2.4 鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)細(xì)胞增殖活性 在96孔板中加入約1 × 104個細(xì)胞懸液，每組設(shè)3 個復(fù)孔，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h（37 ℃，5% CO2），細(xì)胞貼壁后向培養(yǎng)板中加入100 μL 血清（鱉甲煎丸含藥血清或空白對照血清或胎牛血清）。干預(yù)24、48、72 h 后，每孔加入20 μL CCK-8 液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度（OD），進(jìn)行統(tǒng)計分析，重復(fù)3 次。

2.5 鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)對肝癌細(xì)胞周期的影響 取1×106/mL 處于對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞6 孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%左右時棄培養(yǎng)液，加入鱉甲煎丸含藥血清（10%）或空白對照血清培養(yǎng)24 h，消化并收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS 洗滌2 次后加入1 mL 70%乙醇混勻，-20 ℃固定過夜后1 000 r/min、4 ℃下離心10 min，預(yù)冷的PBS 重懸洗滌2 次，按照試劑盒要求加入500 mL PI 染色劑，室溫避光孵育30 min 后上機(jī)檢測。

2.6 鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)對肝癌細(xì)胞凋亡的影響 取1 × 106/mL 處于對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞6 孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%左右時棄培養(yǎng)液，加入鱉甲煎丸含藥血清（10%）或空白對照血清培養(yǎng)24 h，消化并收集細(xì)胞，1 mL Bingding Buffer 重懸后在37 ℃下孵育10 min，1 000 r/min 離心5 min 后棄上清，按照說明書要求加入染色劑Annexin V/PI，室溫避光孵育15 min 后加入Bingding Buffer，上機(jī)檢測。

2.7 總RNA 收集 SMMC-7721 細(xì)胞以5×106/mL接種于T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，過夜培養(yǎng)后棄上清液，PBS 洗滌3 次，加入含10%鱉甲煎丸含藥血清或空白對照血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，細(xì)胞總RNA 提取操作按照Qiagen 公司說明書進(jìn)行。

2.8 差異表達(dá) miRNA/mRNA 分析 使用NanoDrop 檢測樣品純度后，全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析由深圳海一時代基因有限公司完成，測序平臺為Hiseq2500 SE50。采用DEGseq 差異分析軟件篩選差異表達(dá)的miRNA/mRNA，條件為差異倍數(shù)大于等于2、P-value 小于等于0.05。

2.9 KEGG 信號通路富集分析 對有顯著差異的miRNA 和mRNA 進(jìn)行KEGG Pathway 顯著性富集分析，確定差異表達(dá)miRNA 和mRNA 的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2.10 熒光定量PCR 使用PrimeScript Reagent Kit with gDNA Eraser 合成cDNA，操作在Mastercycler ep realplex 實時熒光定量PCR 儀進(jìn)行，每組樣品設(shè)置3 個復(fù)孔。PNMT（正向5′-CCCAGATCTTGCCAGCTTTC-3′，反向5′-GCCCTTGACATCATCTA CGC-3′）和ST8SIA5（正向 5′-CGGGGCTCTTTAATGTCACG-3′，反向 5′-CCCATTTGCACATCTGGAGG-3′）的循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s，收集熒光，共40 個循環(huán)；溶解曲線參數(shù)95 ℃1 min，65～95 ℃以0.1 ℃/s進(jìn)行升溫。通過基于內(nèi)參照GAPDH 的定量分析，目的基因mRNA 表達(dá)量用2-△△Ct計算轉(zhuǎn)錄水平。

2.11 Western Bloting 細(xì)胞總蛋白提取根據(jù)RIPA Lysis Buffer 說明書進(jìn)行，通過BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，按照每孔50 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，用PVDF 膜在半干轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后用封閉液室溫封閉1 h。去除封閉液后加入目的蛋白特異性抗體，在4 ℃下封閉過夜，其中PNMT（1∶1 000）、ST8SIA5（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）抗體經(jīng)抗體稀釋液稀釋。按照ECL 超敏發(fā)光液說明書對膜進(jìn)行孵育，最后在暗房顯影。條帶經(jīng)掃描后，通過Quantity One 軟件進(jìn)行灰度分析。

2.12 生存分析 對TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）中的RNA-seq 包含有生存數(shù)據(jù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)的患者進(jìn)行總Kaplan-Meier 生存分析，并生成總體生存圖。其中，分析樣本分為高表達(dá)（TPM 值在上四分位數(shù)以上）和低/中表達(dá)（TPM 值在上四分位數(shù)以下），患者狀態(tài)為死亡或存活。使用PERL 腳本對基因創(chuàng)建一個帶有For 列的選項卡分隔的輸入文件，包括TCGA 樣本id、時間（days＿ to＿ death 或days＿ to＿ last＿ follow＿up）、狀態(tài)（Alive 或Dead）和表達(dá)式水平（高表達(dá)或低/中表達(dá)），最后對PNMT 基因和ST8SIA5基因進(jìn)行肝細(xì)胞肝癌患者的生存分析。

2.13 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組內(nèi)比較采用One-Way ANOVA 單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 鱉甲煎丸含藥血清抑制肝癌細(xì)胞增殖活性 鱉甲煎丸含藥血清（10%）干預(yù)細(xì)胞株（SMMC-7721 或Huh7 或L-02）后，SMMC-7721 或Huh7 增殖活性明顯受到抑制，在24 h（P ＜0.01）、48 h（P＜0.01）、72 h（P＜0.01）節(jié)點組間與空白對照血清組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A、1B。鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)人正常肝細(xì)胞L-02后，其增殖活性與空白對照血清組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖1C。

圖1 鱉甲煎丸含藥血清對細(xì)胞增殖活性的影響（，n=3）Fig.1 Effect of Biejiajianwan-medicated serum on the proliferation activity of hepatoma carcinoma cells（，n=3）

3.2 鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)對肝癌細(xì)胞周期影響 鱉甲煎丸含藥血清（10%）干預(yù)SMMC-7721 細(xì)胞24 h 后，與空白對照血清組相比，G0/G1期比例增加（P＜0.01），G2/M 期和S 期所占比例減少（P＜0.01），見表1、圖2。

圖2 鱉甲煎丸含藥血清對細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effect of Biejiajianwan-medicated serum on the cell cycles

表1 鱉甲煎丸含藥血清對SMMC-7721 細(xì)胞周期的影響（%，，n=3）Tab.1 Effect of Biejiajianwan-medicated serum on the cell cycle of SMMC-7721 cells（%，，n=3）

表1 鱉甲煎丸含藥血清對SMMC-7721 細(xì)胞周期的影響（%，，n=3）Tab.1 Effect of Biejiajianwan-medicated serum on the cell cycle of SMMC-7721 cells（%，，n=3）

注：與空白對照血清組比較，**P＜0.01。

3.3 鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)對肝癌細(xì)胞凋亡影響與空白對照血清組相比，鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)SMMC-7721 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均提高（P＜0.01），見圖3、表2。

表2 鱉甲煎丸含藥血清對SMMC-7721 細(xì)胞凋亡的影響（%，，n=3）Tab.2 Effect of Biejiajianwan-medicated serum on the apoptosis of SMMC-7721 cells（%，，n=3）

表2 鱉甲煎丸含藥血清對SMMC-7721 細(xì)胞凋亡的影響（%，，n=3）Tab.2 Effect of Biejiajianwan-medicated serum on the apoptosis of SMMC-7721 cells（%，，n=3）

注：與空白對照血清組比較，**P＜0.01。

圖3 鱉甲煎丸含藥血清對細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Biejiajianwan-medicated serum on the cell apoptosis

3.4 差異表達(dá)miRNA/mRNA 分析 對鱉甲煎丸含藥血清、空白對照血清進(jìn)行miRNA、mRNA 差異分析，共得到48 個差異表達(dá)的miRNA 和168 個差異表達(dá)的mRNA，其中差異表達(dá)前20 的miRNA見表3，差異表達(dá)前20 的mRNA 見表4。

表3 前20 的miRNA 差異表達(dá)Tab.3 The 20 most varied miRNA expressions

表4 前20 的mRNA 差異表達(dá)Tab.4 The 20 most varied mRNA expressions

3.5 差異表達(dá)miRNA/mRNA 的KEGG pathway 富集分析 KEGG Pathway 富集分析發(fā)現(xiàn)了差異miRNA/mRNA 背后可能參與調(diào)控的信號通路包括有 Metabolic pathway、MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway 和p53 signaling pathway 等，見圖 4。miRNA 富集分析提示，代謝通路（Metabolic pathway）是其主要的調(diào)控信號通路（圖 4A）；mRNA 富集分析顯示，代謝通路（Metabolic pathway）也是其主要參與的信號通路（圖4B）。

圖4 差異表達(dá)miRNA/mRNA 的KEGG pathway 富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of varied miRNA/mRNA expressions

3.6 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的代謝通路（Metabolic pathway）構(gòu)建 以差異表達(dá)的miRNA/mRNA 為基礎(chǔ)，按照與Metabolic pathway 信號通路的相關(guān)性構(gòu)建miRNA/mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的代謝通路，得到以苯乙醇氨基轉(zhuǎn)移酶（Phenylethanolamine N-methyltransferase，PNMT）、唾液酸轉(zhuǎn)移酶8E（ST8 Alpha-N-Acetyl-Neuraminide Alpha-2，8-Sialyltransferase 5，ST8SIA5）為核心mRNA，以hsamiR-3196 和 hsa-miR-6762-5p 為核心 miRNA 的miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)代謝通路，見圖5。

圖5 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的代謝通路Fig.5 Metabolic pathway of miRNA-mRNA regulatory network

3.7 鱉甲煎丸含藥血清對PNMT 和ST8SIA5 表達(dá)的影響 分別用0、5%、10%鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)細(xì)胞24 h 后檢測PNMT 和ST8SIA5 的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。結(jié)果顯示，鱉甲煎丸含藥血清可依賴濃度梯度下調(diào)PNMT 的mRNA、蛋白表達(dá)（圖6A、7A），依賴濃度梯度上調(diào)ST8SIA5 的mRNA、蛋白表達(dá)（圖6B、7B）。

圖6 鱉甲煎丸含藥血清對PNMT 和ST8SIA5 mRNA 表達(dá)的影響Fig.6 Effect of Biejiajianwan-medicated serum on the expressions of PNMT and ST8SIA5 mRNA

圖7 鱉甲煎丸含藥血清對PNMT 和ST8SIA5 蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of Biejiajianwan-medicated serum on expressions of PNMT and ST8SIA5 proteins

3.8 PNMT 和ST8SIA5 表達(dá)量對肝細(xì)胞肝癌患者的生存時間的影響 PNMT 高表達(dá)組的患者生存率低于低/中表達(dá)組（P＜0.05），而ST8SIA5 高表達(dá)組、低/中表達(dá)組的患者生存率無顯著差異（P ＞0.05），見圖8。

圖8 PNMT 和ST8SIA5 在肝細(xì)胞肝癌病人的生存分析Fig.8 Analysis of PNMT and ST8SIA5 levels-associated HCC patients survival

4 討論

根據(jù)我國腫瘤登記中心的數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，我國每年新發(fā)HCC 病例在所有惡性腫瘤中位居第3 位，其中，每年因HCC 死亡的病例位居全國惡性腫瘤死亡第2 位，死亡率為16.84/10 萬［2]，由此可見，HCC 不僅嚴(yán)重威脅國人的健康，也對整個社會造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。目前，關(guān)于HCC 治療的方法包括手術(shù)切除、肝臟移植、放療、化療、栓塞、介入治療和分子靶向治療等［5]，但是效果仍不能令人滿意，因此，尋找探索新的HCC 治療的靶點以及分子機(jī)制顯得尤為迫切。miRNA 是一類短小且高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA［6]，在肝癌細(xì)胞和組織中都可以檢測到其異常表達(dá)，它們通過調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域來影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程［7]，通過靶向調(diào)控促癌mRNA 或者抑癌mRNA的表達(dá)來達(dá)到靶向治療HCC 是一個新的方向。因此，尋找和鑒定出與HCC 相關(guān)的miRNA 以及其靶基因，闡明具體作用機(jī)制就顯得十分重要。

在本研究中首先觀察到鱉甲煎丸含藥血清（10%）作用于肝癌細(xì)胞后通過CCK-8 法檢測其增殖活性時，在24、48、72 h 發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸含藥血清組細(xì)胞增殖活性受到抑制，與空白對照血清組比較有顯著差異（圖1）。其次，在細(xì)胞周期實驗中發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸含藥血清（10%）作用于肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞的G0/G1期比例顯著增加（表1、圖2），這說明鱉甲煎丸可能是通過使肝癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，進(jìn)而抑制其增殖。最后，在細(xì)胞凋亡實驗中發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸干預(yù)后，可顯著提高肝癌細(xì)胞的凋亡率（表2、圖3）。

為了進(jìn)一步明確鱉甲煎丸抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的潛在分子機(jī)制，應(yīng)用鱉甲煎丸含藥血清與SMMC-7721 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 后，通過全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)檢測到該過程有48 個差異表達(dá)miRNA，包括有hsa-miR-4699-5p、hsa-miR-3196 和hsa-miR-6762-5p 等（表3）；有168 個表達(dá)差異mRNA，包括PNMT、PDIA2、ST8SIA5 和ACTL8等（表4）。通過差異表達(dá)miRNA 和mRNA 的KEGG pathway 富集分析發(fā)現(xiàn)，代謝通路（Metabolic pathway）是最關(guān)鍵的信號通路之一（圖4）。再構(gòu)建代謝途徑的miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)PNMT 基因、ST8SIA5 基因、hsa-miR-3196 和hsa-miR-6762-5p 可能是鱉甲煎丸調(diào)控代謝通路抑制肝癌細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控點（圖5）。最后通過實時熒光定量PCR 和Western Bloting 驗證，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可顯著下調(diào)PNMT 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，且呈劑量依賴（圖6A、7A）；顯著上調(diào)ST8SIA5 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，同樣呈劑量依賴（圖6B、7B）。

PNMT 多見于嗜鉻細(xì)胞瘤中高表達(dá)［8]，是Wnt信號通路的重要中間分子［9]，而Wnt 通路目前被發(fā)現(xiàn)是鱉甲煎丸抑制肝癌細(xì)胞的重要通路［10-11]，在乳腺癌中處于高表達(dá)狀態(tài)，其蛋白產(chǎn)物及去甲腎上腺素和腎上腺素退化通路可能與乳腺癌的耐藥性有關(guān)［12]。而生存分析結(jié)果顯示，高表達(dá)PNMT 的肝細(xì)胞肝癌患者其生存期顯著低于低/中表達(dá)組（圖8A，P=0.047），這提示鱉甲煎丸可能通過下調(diào)PNMT 影響Wnt 信號通路來抑制肝癌細(xì)胞。另外，ST8SIA5 是以胞苷-磷酸-β-N-乙酰神經(jīng)氨酸為底物的糖基轉(zhuǎn)移酶，它是α-2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族的成員之一［13]，在不同腫瘤中均存在差異表達(dá)，被視作治療的潛在靶點［14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織和癌旁組織中ST8SIA5 的出現(xiàn)差異表達(dá)狀態(tài)［15]，高表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答行為［16]，這提示鱉甲煎丸可能通過上調(diào)ST8SIA5 來影響肝癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞的應(yīng)答行為。雖然生存分析結(jié)果顯示，高表達(dá)ST8SIA5 的肝細(xì)胞肝癌患者生存期與低/中表達(dá)組相比無顯著差異（圖8B，P=0.066），但仍可以繼續(xù)挖掘ST8SIA5與肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥性等的關(guān)系。目前，關(guān)于PNMT 和ST8SIA5 在肝癌中的分子機(jī)制仍鮮有文獻(xiàn)報道，因此，進(jìn)一步挖掘兩者在鱉甲煎丸抑制肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制顯得十分的有意義。

綜上所述，鱉甲煎丸可以抑制肝癌細(xì)胞，涉及了許多miRNA、mRNA 和信號通路的參與，其中代謝通路（Metabolic pathway）及PNMT、ST8SIA5分別是其發(fā)揮作用的重要通路、核心基因。因此，進(jìn)一步挖掘PNMT 和ST8SIA5 基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，對于闡明鱉甲煎丸抑制肝癌的分子機(jī)制和探索新的肝癌治療靶點具有重要意義。