HPLC-ELSD 法同時(shí)測定舒血寧注射液中4 種銀杏內(nèi)酯

胡夢婷，王若柳，佟美鴻，康 寧，王書芳*

（1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 虎林 158400）

舒血寧注射液是銀杏葉經(jīng)過提取、柱層析等工藝過程制成的中藥注射劑，功能主治擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)［1]，銀杏內(nèi)酯是其藥效物質(zhì)［2-6]，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)［7]、心腦血管的缺血性損傷［8]均具有保護(hù)作用，但該成分紫外吸收很弱，目前大多采用HPLCELSD 或LC-MS 法測定銀杏內(nèi)酯A、B、C、白果內(nèi)酯含量［9-13]，另有報(bào)道采用HPLC-Q-TOF-MS 法測定銀杏種子、銀杏葉、銀杏根皮中銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、白果內(nèi)酯的含量［14]，但相關(guān)儀器價(jià)格昂貴，而且質(zhì)譜檢測器的重復(fù)性不如紫外檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器，不適合生產(chǎn)過程中的日常檢驗(yàn)。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，舒血寧注射液中除了銀杏內(nèi)酯A、B、C 外，還含有一定量銀杏內(nèi)酯J，故本實(shí)驗(yàn)在《舒血寧注射液國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》 的基礎(chǔ)上增加了該成分含量測定。舒血寧注射液原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的樣品前處理方法是用2 mL 丙酮進(jìn)行復(fù)溶，但該溶劑揮發(fā)性強(qiáng)，而且屬于第三類易制毒品，購買不便，因此改成5 mL 甲醇，然后建立HPLCELSD 法同時(shí)測定其中銀杏內(nèi)酯A、B、C、J 的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配置四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、蒸發(fā)光散射檢測器、Chemstation 工作站控制系統(tǒng)；AE 240 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AG22331 型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Millipore 超純水器（美國Millipore 公司）。

銀杏內(nèi)酯A（批號(hào) 100086-201612，純度97.4%）、銀杏內(nèi)酯B（批號(hào)110863-201611，純度95.6%）、銀杏內(nèi)酯C（批號(hào)110864-201508，純度99.8%）對(duì)照品，均購自中國食品藥品檢定研究院；銀杏內(nèi)酯J 對(duì)照品（批號(hào)Z12S8X41702，純度98%），購自上海源葉生物科技有限公司。甲醇為色譜純，購自德國Merck 公司；乙酸乙酯、無水乙酸鈉、四氫呋喃均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；去離子水，由Milli-Q 超純水系統(tǒng)過濾得到。

舒血寧注射液由A 公司提供，其中A 廠家2 mL的10 批，5 mL 的13 批；B 廠家2 mL 的1批，5 mL 的7 批；C 廠家5 mL 的1 批；D 廠家5 mL的7 批；E 廠家2 mL 的3 批，5 mL 的4 批；F 廠家5 mL 的14 批；G 廠家5 mL 的14 批；H 廠家2 mL 的1 批，共75 批。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-四氫呋喃-水（20∶10∶75）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)為漂移管溫度65 ℃；增益7；氣速3 bar（1 bar=100 kPa）。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯J 對(duì)照品適量，甲醇制成每1 mL 分別含四者0.946 0、0.836 0、0.830 0、0.929 0 mg 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取舒血寧注射液15 mL，加稀鹽酸2 滴，調(diào)節(jié)pH 值至2，乙酸乙酯萃取4 次，體積分別為20、10、10、10 mL，合并乙酸乙酯層，20 mL 5%醋酸鈉溶液洗滌，取乙酸乙酯層，醋酸鈉溶液再以10 mL 乙酸乙酯洗滌，合并乙酸乙酯液，20 mL 水洗滌2 次，合并乙酸乙酯，蒸干后甲醇復(fù)溶并定容至5 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取空白溶劑及對(duì)照品、供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，見圖1。由此可知，各銀杏內(nèi)酯附近無其他成分干擾，分離度良好。

圖1 各銀杏內(nèi)酯HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of variouis constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各銀杏內(nèi)酯在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各銀杏內(nèi)酯線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various ginkgolides

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批舒血寧注射液，由同一操作人員按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得銀杏內(nèi) 酯J、C、A、B 含量RSD 分別 為3.9%、4.0%、2.8%、3.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取同一批舒血寧注射液，由不同操作人員按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得銀杏內(nèi)酯J、C、A、B 含量RSD 分別為2.1%、4.3%、3.7%、3.2%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批舒血寧注射液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于24 h內(nèi)在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得銀杏內(nèi)酯J、C、A、B 峰面積RSD 分別為3.3%、2.4%、2.3%、3.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各銀杏內(nèi)酯含量已知的同一批舒血寧注射液（廠家A），分別按約50%、100%、150%水平精密加入對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備低、中、高質(zhì)量濃度供試品溶液各3 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各銀杏內(nèi)酯加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests for various ginkgolides（n=9）

2.8 樣品含量測定 吸取8 個(gè)廠家75 批舒血寧注射液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，平行2 次，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各銀杏內(nèi)酯含量測定結(jié)果（n=2）Tab.3 Results of content determination of various ginkgolides（n=2）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)檢測了8 個(gè)廠家75 批舒血寧注射液中4 種銀杏內(nèi)酯的含量，發(fā)現(xiàn)不同廠家各銀杏內(nèi)酯含量差異較大，RSD 18.4%～28.0%，在同一廠家中，A、E 廠家RSD分別 為7.2%～11.8%、4.9%～11.6%，質(zhì)量一致性較好；銀杏內(nèi)酯J 含量占總銀杏內(nèi)酯含量的比例為3.7%～15.9%。究其原因，可能是由于不同廠家所用銀杏葉的產(chǎn)地批次不同，工藝也有所差別，同時(shí)內(nèi)酯類成分穩(wěn)定性差，也導(dǎo)致其含量存在一定的波動(dòng)。此外，現(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了舒血寧注射液中銀杏內(nèi)酯A、B、C 及三者總和的最低含量，過于寬泛，廠家難以嚴(yán)格控制，故建議增加銀杏內(nèi)酯含量上限規(guī)定，以期進(jìn)一步提升該制劑的批次一致性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-ELSD 法同時(shí)測定舒血寧注射液中銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯J 的含量，發(fā)現(xiàn)該方法重復(fù)性、準(zhǔn)確度較好，但不同廠家各銀杏內(nèi)酯含量差別較大，故有必要提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以保證產(chǎn)品批次一致性。