石榴皮半仿生提取工藝的優化

王京龍，史 磊，鄭丹丹，張立華，王占一，王 飛，孫秀梅，劉紫璇

（1.棗莊學院，山東 棗莊 277160；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355）

石榴皮屬于傳統收斂固澀藥，為石榴科石榴Punica granatum L.的干燥果皮，臨床常用于久瀉、久痢等癥［1]。它富含鞣質等多種酚類成分［2]，具有抗菌［3]、抗病毒［4]、抗腫瘤［5]、抗氧化［6]、保護胃腸黏膜［7]等藥理作用。

半仿生提取法是基于“灰思維”方式模擬人體胃腸環境，采用特定酸堿度水依次連續提取，從生物藥劑學角度為口服給藥制劑提供的一種新技術，被廣泛應用于多種活性成分的提?。?-10]。石榴皮中鞣花單寧、沒食子單寧等大分子物質［11]脂溶性差，口服給藥后血液中幾乎檢測不到原型成分，而是以鞣花酸、沒食子酸及其代謝產物為主［12-13]。采用半仿生法提取時，酸堿環境有利于鞣質的水解，增加鞣花酸等活性成分的提取率。

因此，本實驗擬通過層次分析法（AHP）、基于指標相關性的權重確定方法（CRITIC）的混合加權來優化權重分配［14-15]，再采用均勻試驗篩選最佳工藝參數，優化石榴皮半仿生提取工藝。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置四元泵、VWD 檢測器、柱溫箱，購自美國安捷倫科技公司；UV-2600 紫外-可見全波長掃描儀，購自日本島津公司；MSA-3.6P-0CE-DM 電子天平（百萬分之一），購自德國賽多利斯公司；Vortex 2 渦旋混合儀，購自德國IKA 公司；N-1200BV-WD 旋轉蒸發儀，購自東京理化器械株式會社；PHS-3C PH 計，購自上海雷磁儀器廠；3k-15 離心機，購自美國Sigma 公司。

石榴采自山東棗莊冠世榴園，經棗莊學院張立華教授鑒定為崗榴石榴Punica granatum L.，剝取果皮，陰干備用。沒食子酸（B20851-20 mg，純度≥98%）、鞣花酸（B21073-20 mg，純度≥98%）對照品，均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，均購自德國Merck 公司；磷酸為色譜純，購自美國阿拉丁工業公司；其余試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 提取液制備 將石榴皮粉碎后取10～20 目之間的粉末15 g，調節溶劑pH 值，常壓回流提取3次（用水量比例10∶8∶8，提取時間2∶1∶1），濾過，4 000 r/min 離心15 min，合并，定容至500 mL量瓶中，即得（編號SBE1～SBE9，質量濃度為30 mg/mL）。

2.2 沒食子酸、鞣花酸含量測定

2.2.1 色譜條件 Hypersil ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相水（含0.4% 磷酸）（A）-（甲醇-乙腈）（1∶1）（B），梯度洗脫（0～11 min，3%B，檢測波長270 nm，體積流量0.8 mL/min；12～25 min，30%B，檢測波 長254 nm，體積流量1 mL/min）；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品2.00 mg，置于10 mL 量瓶中，超純水溶解定容至刻度；精密稱取鞣花酸對照品2.62 mg，置于10 mL棕色量瓶中，DMSO 溶解，超純水定容至刻度。精密吸取上述2 種溶液各5 mL，渦旋振蕩混合均勻，即得（沒食子酸、鞣花酸質量濃度分別為0.10、0.13 mg/mL）。

2.2.3 供試品溶液制備 精密量取“2.1”項下提取液各5 mL，置于25 mL 量瓶中，加水定容，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得（編號A1～A9，質量濃度為6.0 mg/mL），-4 ℃下保存。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.2”項下對照品溶 液 2.0、5.0、10、15、20 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行回歸，得沒食子酸、鞣花酸方程分別為Y=3 635.6X-3.214 6（R2=0.999 6）、Y=10 380X+750.5（R2=0.999 7），分別在0.2～2.0、0.26～2.620 μg 范圍呈良好的線性關系。

2.2.5 日內精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液，同一天內在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，每次20 μL，測得沒食子酸、鞣花酸峰面積RSD 分別為1.48%、0.67%，表明該方法日內精密度良好。

2.2.6 日間精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液，每天在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定3 次，每次20 μL，連續3 d，測得沒食子酸、鞣花酸峰面積RSD 分別為1.86%、2.35%，表明該方法日間精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 精密吸取“2.2.3 項下供試品溶液（A1），于0、2、6、12、24 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、鞣花酸峰面積RSD 分別為1.27%、1.96%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.8 重復性試驗 取“2.1”項下提取液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液（A1）6 份，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、鞣花酸峰面積RSD 分別為2.31%、2.49%，表明該方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 精密吸取“2.1”項下提取液（SBE1）5.0 mL，共6 份，精密加入沒食子酸對照品0.15 mg 左右，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸平均加樣回收率為99.05%，RSD 為2.32%。精密吸取“2.1”項下提取液（SBE1）5.0 mL，共6 份，精密加入鞣花酸對照品1.5 mg 左右，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，測得鞣花酸平均加樣回收率為98.12%，RSD 為2.15%。

2.3 總酚含量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品10.0 mg，置于10 mL 量瓶中，超純水溶解，定容，即得（質量濃度為1.0 mg/mL）。

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.3.1”項下對照品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于25 mL 量瓶中，加入酒石酸亞鐵溶液6 mL，搖勻后靜置10 min，pH7.5 磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，靜置30 min 顯色，以0 管為空白，在540 nm 波長處用紫外分光光度計測定吸光度［16]。以吸光度為縱坐標（A），對照品質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得到方程為A=14.336X+0.000 9（R2=0.999 4），在0.008～0.048 mg/mL 范圍內線性關系良好。

2.3.3 日內精密度試驗 取“2.3.1”項下對照品溶液0.4 mL，按“2.3.2”項下方法測定6 次吸光度，測得其RSD 為1.52%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 日間精密度試驗 取“2.3.1”項下對照品溶液，每天按“2.3.2”項下方法測定3 次吸光度，連續3 d，測得其RSD 為2.54%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗 精密吸取“2.2.3”項下供試品溶液（A1）1.0 mL，于0、2、6、12、24 h 按“2.3.2”項下方法測定吸光度，測得其RSD 為2.50%，表明溶液24 h 內穩定性良好。

2.3.6 重復性試驗 取“2.1”項下提取液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液（A1）6 份，各取1.0 mL，按“2.3.2”項下測定吸光度，測得其RSD 為2.45%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密吸取“2.1”項下供試品溶液（A1）1.0 mL，共6 份，精密加入沒食子酸對照品0.37 mg 左右，渦旋混合，按“2.3.2”項下方法測定吸光度，測得總酚平均加樣回收率為96.05%，RSD 為2.20%。

2.4 干浸膏得率測定 精密量取“2.1”項下提取液SBE1～SBE9各20.0 mL，置于已烘干至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，置于減壓干燥箱中，80 ℃下反復干燥至恒重，測定干浸膏得率。

2.5 均勻設計 本實驗對一煎pH（A）、二煎pH（B）、三煎pH（C）、提取總時間（D）采用U9（91×33）均勻設計表進行設計，結果見表1。

表1 均勻設計結果Tab.1 Results of uniform design

2.6 指標權重確定

2.6.1 AHP 法 結合石榴皮藥效物質含量、藥理作用強弱等方面，將各成分含量、干浸膏得率的權重分為4 個層次進行量化。由于石榴皮主要藥效物質為鞣質等多元酚，其中鞣花酸、沒食子酸活性較突出，故設定各指標主次順序為總酚含量＞鞣花酸含量＞沒食子酸含量＞干浸膏得率，構建成對比較優先判斷矩陣，見表2。經層次分析后，權重系數分別為總酚含量49.180%，鞣花酸含量24.590%，沒食子酸含量16.393%，干浸膏得率9.836%，隨機一致性RI 值0.89，一致性比列因子CR=0.000＜0.10，表明指標優先比較判斷矩陣滿足一致性檢驗。

表2 各指標成對比較的優先判斷矩陣Tab.2 Priority judgment matrices for paired comparison of various indices

2.6.2 CRITIC 法 CRITIC 法是客觀反映指標權重的計算方法［15，17]，它通過線性插值處理將考察指標間的對比強度和沖突性體現出來，較主觀賦分法更客觀科學。將表1 數據進行線性插值處理，通過SPSS 17.0 軟件計算指標之間的變異性（Si）、沖突性（δi）、綜合權重（ci）、權重（ω），結果見表3。

表3 CRITIC 法所得各指標的參數Tab.3 Parameters for various indices obtained by CRITIC method

2.6.3 AHP-CRITIC 法 計算公式為綜合權重其中ωAHP-ij表示AHP 法處理的權重值，ωCRITIC-ij表示CIRTIC 法處理的權重值，i 表示第i 個因素，j 表示第j 個樣本。結果，總酚含量、鞣花酸含量、沒食子酸含量、干浸膏得率的權重系數分別為46.68%、28.51%、14.44%、10.37%。

2.6.4 權重方法比較 將表1 數據分別用3 種權重系數進行計算，再通過SPSS17.0 軟件進行相關性分析。結果，AHP 法與AHP-CRITIC 法的相關系數為0.997，CRITIC 法與AHP-CRITIC 法的相關系數為0.889，AHP 法與CRITIC 法的相關系數為0.908，均有顯著相關性（P＜0.05）；但比較AHP法、CRITIC 法的權重系數時發現，兩者相關系數為-0.174，相關性不顯著（P=0.826＞0.05），表明2 種方法賦值反應的信息無疊加性。

2.7 提取工藝確定 將“2.2”至“2.4”項下各指標按公式進行標準化處理，其中x′i.j表示標準化后數值，xi.j表示樣品液i 中成分j的含量，表示樣品液i 中成分j 的平均值，sj表示成分j 的標準偏差，按“2.6”項下公式計算綜合權重，再計算綜合評分Y，公式為Y=總酚含量×46.68%+鞣花酸含量×28.51% +沒食子酸含量×14.44%+干浸膏得率×10.37%。

通過SPSS17.0 軟件，對表1 各指標標準化數值和綜合評分Y 進行二次多項式逐步回歸，得方程為Y=-3.428+0.079AD+0.034C2，P=0.006 ＜0.01，可知模型有統計學意義，并且一煎pH 值（A）、三煎pH 值（C）、提取時間（D）對提取效果有顯著影響（P＜0.05）。將回歸方程規劃求解預測，得到最優工藝為A=6.0，B=7.36，C=9.0，D=4.0 h，預測值為Y=1.222 0。結合實際操作，確定一煎pH、二煎pH、三煎pH 分別為6.0、7.4、9.0，提取時間分別為2.0、1.0、1.0 h。

2.8 驗證試驗 將石榴皮粉碎（10～20 目）后稱取15 g，根據優化工藝制備提取液，按“2.2”至“2.5”項下方法測定鞣花酸、沒食子酸、總酚含量及干浸膏提取率，各指標按“2.7”項下方法處理，得到綜合評分Y′，結果見表4。由此可知，Y′為1.251 8，與預測值1.222 0 接近，表明該工藝合理可行。

表4 驗證試驗結果（n=3）Tab.4 Results of verification tests（n=3）

3 討論

石榴皮屬于收斂固澀藥，活性成分主要為鞣質類，以鞣花酸單寧、沒食子單寧為主，但大量研究表明［12-13]，鞣質類大分子物質很難以原型吸收入血，在腸道酸堿條件下分解，入血成分大多為鞣花酸、沒食子酸、尿石素類代謝產物［18]等小分子酚類物質。因此，本實驗選擇總多酚及其分解產物鞣花酸、沒食子酸作為主要考察指標，發現在最優半仿生提取工藝下兩者提取率分別達到相同條件下水提液的5、4 倍左右，表明該工藝提取后石榴皮中部分鞣質類成分轉化成小分子酚類化合物，更有利于胃腸道快速吸收。

在HPLC 法測定鞣花酸、沒食子酸含量時，采用可變波長梯度洗脫法，發現兩者最大吸收波長分別為254、270 nm，由于后者含量較低，故前11 min選擇270 nm，后13 min 選擇254 nm，此時2 種成分峰形、分離度均較好。

中藥提取工藝的優化要體現中醫藥整體觀念，故必須選取多個指標進行綜合評判。本實驗將層次分析法（AHP）和客觀賦值法（CRITIC）作混合加權處理，既能體現各指標對中藥貢獻度的差異，又可充分平衡各數據沖突性、變異性所帶來的影響，較單一賦權法更具科學性。驗證試驗結果表明，所得最優工藝參數合理可行，可為石榴皮的進一步研究提供依據。