大黃酚白蛋白納米粒的制備及其體內藥動學研究

辛 娟，易 華，談秀鳳，丁 玉

（1.黃河科技學院，河南 鄭州 450063；2.上海中醫藥大學，上海 201203）

大黃是中藥制劑常用藥味之一［1-3]，大黃酚是其主要成分，具有清熱解毒、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、改善腦損傷、調血脂等多種作用［4-5]，但該成分在25 ℃時的溶解度僅為0.96 μg/mL，而且容易氧化，導致其口服吸收較差［6]，而且對胃腸道也有一定的刺激作用［6]。納米技術可有效促進藥物吸收［7]，目前大黃酚相關制劑有脂質體、納米囊、膠束等［6，8]，但存在制備工藝復雜、需使用表面活性劑、載藥量低等缺陷。

近年來，采用白蛋白作為納米載體的研究越來越多［9-11]，其分子結構中的氨基酸以肽鍵一一相連，并在空間上扭曲成團，形成了網狀空隙結構和疏水區域，非常有利于攜帶、鑲嵌或結合藥物［12]，Bioscience 公司開發的NabTM技術所制備的紫杉醇白蛋白納米制劑Abraxane? 已被FDA 批準用于臨床。因此，本實驗采用來源廣泛的牛血清白蛋白，參考NabTM技術將大黃酚制成白蛋白納米粒，并對其進行表征，以期通過白蛋白納米粒促進該成分體外溶出和體內吸收，并為相關制劑革新提供參考。

1 材料

U3000 型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；Milli-Q 超純水處理系統（美國Millipre 公司）；PL203 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DF-101S 型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；BDF-86V55 型超低溫冰箱（山東博科再生醫學有限公司）；JY92-II 型超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BKFD10S 型凍干機（山東博科生物產業有限公司）；Master-sizer 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；MD200-2 型氮氣吹掃儀（杭州奧威儀器有限公司）；Nanosep? 超濾離心管（截留相對分子質量10 000，美國Pall 公司）；H-7240 型透射電鏡（日本Hitachi 公司）。

大黃酚對照品（批號110757-201808，純度98.6%，中國食品藥品檢定研究院）；大黃酚原料藥（批號170915，純度98.0%，武漢遠城科技發展有限公司）；牛血清白蛋白（批號201901118，白蛋白純度≥98%，上海藍季生物科技公司）。甲醇（批號I1088607-017，德國默克公司）。SD 大鼠購自河南省動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK（豫）2016-0001，先在實驗室飼養3 d，實驗開始時選擇體質量（300±20）g 者進行研究。

2 方法與結果

2.1 大黃酚白蛋白納米粒及其凍干粉制備 參考文獻［13] 報道的方法，稱取處方量大黃酚至一定體積二氯甲烷中，超聲處理30 s 溶解，作為有機相；蒸餾水配制含4%白蛋白的溶液80 mL，作為水相，將有機相緩慢滴加至水相中，并于細胞粉碎儀（功率300 W，每間隔2 s 工作2 s）超聲處理，得O/W 初乳，在45 ℃下減壓旋蒸除去有機相，過0.45 μm 微孔濾膜，加蒸餾水至80 mL，分裝至西林瓶中，置于-60 ℃超低溫冰箱中冷凍2 d，再迅速轉移至-40 ℃冷凍干燥機中2 d，即得。

2.2 大黃酚含量測定

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.1% 磷酸-甲醇（25∶75）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長429 nm；進樣量20 μL。

2.2.2 方法學考察 稱取大黃酚對照品10 mg 至100 mL 量瓶中，1 mL 二甲基亞砜超聲溶解，甲醇定容至刻度，得100 μg/mL 貯備液，取適量，加入0.1% 磷酸-甲醇（25∶ 75）制成10、5、1、0.5、0.1、0.02 μg/mL 對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為Y=1.821 5X-0.069 2（r=0.999 8），在0.02～10 μg/mL 范圍內線性關系良好。

取大黃酚白蛋白納米粒凍干粉約10 mg 至100 mL量瓶中，蒸餾水復溶后取2.5 mL 至10 mL量瓶中，甲醇沉淀蛋白，超聲處理5 min 后甲醇定容至刻度，過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液，平行6 份，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得大黃酚峰面積RSD 為1.37%，表明該方法重復性較好。取同一份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得大黃酚峰面積RSD 為0.22%，表明儀器精密度較好。取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得大黃酚峰面積RSD 為0.49%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。取9 份凍干粉，每份10 mg，置于100 mL量瓶中，分別加入大黃酚對照品0.65、1.30、1.95 mg 各3 份，蒸餾水復溶，取2.5 mL 至10 mL量瓶中，加入甲醇沉淀蛋白，超聲提取5 min，甲醇定容至刻度，過0.22 μm 微孔濾膜，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，大黃酚平均加樣回收率分別為100.38%、99.26%、100.11%，RSD 分別為0.43%、1.14%、0.83%。

2.3 包封率、載藥量測定 采用低溫超濾法。取1 mL 大黃酚白蛋白納米粒混懸液至超濾離心管（截留分子量為20 kDa）中，-4 ℃下6 000 r/min離心20 min，取濾液，HPLC 法測定游離大黃酚的量（m游離）；取1 mL 混懸液至10 mL 量瓶中，加入甲醇沉淀蛋白，超聲處理5 min 后甲醇定容至刻度，過0.22 μm 微孔濾膜，HPLC 法測定總量（m總），計算包封率、載藥量，公式分別為包封率=［（m總-m游離）/m總] × 100%、載藥量=［（m總-m游離）/m總質量] ×100%，其中m總質量為大黃酚白蛋白納米粒的總質量。

2.4 單因素試驗 前期預試驗結果顯示，有機相體積、藥物用量、超聲功率、超聲時間均會對包封率、粒徑產生一定影響，故本實驗對上述因素進行考察。另外，牛血清白蛋白除了作為載體外，還可當做凍干保護劑，但其質量分數低于3.5%時所制備凍干粉末的性質不理想，故固定為4%。

2.4.1 有機相體積 固定藥物用量0.5 g、4%白蛋白溶液體積80 mL、超聲功率300 W、超聲時間6 min，通過改變有機相（二氯甲烷）體積（5、8、10、12 mL）來考察白蛋白納米粒對包封率、粒徑、PDI 的影響，結果見表1。由此可知，當有機相體積為10 mL 時包封率最高，粒徑、PDI 相對理想；為12 mL 時雖然粒徑最小，但包封率有所下降，最終確定有機相體積為10 mL。

表1 有機相體積對包封率、粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.1 Effects of organic phase volume on encapsulation efficiency，particle size and PDI（n=3）

2.4.2 藥物用量 固定有機相體積10 mL、4%白蛋白溶液體積80 mL、超聲功率300 W、超聲時間6 min，通過改變藥物（大黃酚）用量（0.4、0.45、0.5、0.55 g）來考察白蛋白納米粒對包封率、粒徑、PDI 的影響，結果見表2。由此可知，當藥物用量超過0.5 g 時包封率有所下降，而且粒徑、PDI 均有一定程度的上升，可見在一定條件下白蛋白攜帶藥物能力有一定限制，最終確定藥物用量為0.5 g。

表2 藥物用量對包封率、粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.2 Effects of drug consumption on encapsulation efficiency，particle size and PDI（n=3）

2.4.3 超聲功率 固定有機相體積10 mL、藥物用量0.5 g、4%白蛋白溶液體積80 mL、超聲時間6 min，通過改變超聲功 率（200、250、300、350 W）來考察白蛋白納米粒對包封率、粒徑、PDI 的影響，結果見表3。由此可知，隨著超聲功率增加粒徑逐漸下降，為350 W 時包封率開始下降，PDI 明顯上升，最終確定超聲功率為300 W。

表3 超聲功率對包封率、粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.3 Effects of ultrasonic power on encapsulation efficiency，particle size and PDI（n=3）

2.4.4 超聲時間 固定有機相體積10 mL、藥物用量0.5 g、4% 白蛋白溶液80 mL、超聲功率300 W，通過改變超聲時間（4、6、8、10 min）來考察白蛋白納米粒對包封率、粒徑、PDI 的影響，結果見表4。由此可知，當超聲時間超過6 min后粒徑變化不大，但PDI 增加，包封率開始下降，最終確定超聲時間為6 min。

表4 超聲時間對包封率、粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.4 Effects of ultrasound time on encapsulation efficiency，particle size and PDI（n=3）

2.4.5 驗證試驗 根據上述試驗結果，選擇有機相體積為10 mL，藥物用量為0.5 g，超聲功率為300 W，超聲時間為6 min，所制得的大黃酚白蛋白納米粒外觀見圖1，平行3 批，測得平均包封率為（93.61±1.02）%，載藥量為（12.19±1.03）%。

圖1 大黃酚白蛋白納米粒外觀Fig.1 Appearance of chrysophanol albumin nanoparticles

2.5 粒徑、Zeta 電位、形態 取3 份大黃酚白蛋白納米粒，每份0.1 mL，加入10 mL 蒸餾水稀釋，激光粒度儀測定粒徑、PDI、Zeta 電位，結果見圖2～3，可知其平均粒徑為（156.5±6.7）nm，PDI為0.025±0.007，Zeta 電位為（-35.1±3.8）mV。再將白蛋白納米粒混懸液用1.5%磷鎢酸負染，置于透射電鏡儀上觀察形態，結果見圖4，可知它呈球形。

圖2 大黃酚白蛋白納米粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of chrysophanol albumin nanoparticles

圖3 大黃酚白蛋白納米粒Zeta 電位Fig.3 Zeta potential of chrysophanol albumin nanoparticles

圖4 大黃酚白蛋白納米粒透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron microscope image for chrysophanol albumin nanoparticles

2.6 溶解度測定 采用飽和溶劑法。取過量大黃酚及其白蛋白納米粒凍干粉，置于三角瓶中，加入5 mL蒸餾水得混懸液，25 ℃下800 r/min 磁力攪拌3 d，12 000 r/min離心10 min，取上清液進行測定。結果，大黃酚溶解度為（0.96±0.08）μg/mL，而其白蛋白納米粒升高至（34.75±0.92）μg/mL。

2.7 體外釋藥行為研究 取大黃酚及其白蛋白納米粒凍干粉適量（大黃酚量均為5 mg），加入3 mL溶出介質，振蕩混勻后置于透析袋中（截留分子質量為10 000 Da）。溶出介質為900 mL 0.5%十二烷基硫酸鈉，轉速、溶出介質溫度分別設定為75 r/min、37 ℃，根據預實驗確定的取樣點取樣3 mL，同時補充3 mL 空白溶出介質，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，繪制溶出曲線，結果見圖5。由此可知，原料藥48 h 內累積溶出度僅為24.46%，而白蛋白納米粒升高至74.81%，表明該劑型對大黃酚具有明顯的促溶出作用，有利于增加藥物口服吸收，提高其生物利用度。

圖5 大黃酚體外溶出曲線（n=6）Fig.5 In vitro dissolution curves for chrysophanol（n=6）

2.8 體內藥動學研究

2.8.1 分組、給藥與采血 取大鼠12 只，禁食過夜后隨機分為大黃酚組、大黃酚白蛋白納米粒組，每組6 只，自由飲用生理鹽水。取大黃酚及其白蛋白納米粒凍干粉適量，0.5% CMC-Na 溶液配制成5 mg/mL混懸液（臨用現配），并按20 mg/kg 劑量灌胃給藥。大黃酚組大鼠于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8 h 眼眶采血約0.2 mL，大黃酚白蛋白納米粒組大鼠采血點增加10、12 h，血樣置于肝素浸潤的離心管中，2 500 r/min 離心2 min，上層血漿保存于-15 ℃冰箱中。

2.8.2 血漿樣品處理 根據文獻［14] 報道的方法，并對處理過程略作修改。精密量取血漿100 μL，加入500 μL 甲醇渦旋1 min，沉淀蛋白，8 000 r/min 離心10 min，分取上清液，置于氮吹儀中，50 ℃下緩慢吹干得殘渣，加入100 μL 流動相復溶，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，記錄峰面積。

2.8.3 線性關系考察 取大黃酚對照品溶液，空白血漿制成0.05、0.2、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL血漿對照品溶液，按“2.8.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y=0.159 2X-0.018 5（r=0.996 4），在0.05～8.0 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.8.4 方法學考察 空白血漿配制0.05 μg/mL（低）、1.0 μg/mL（中）、8.0 μg/mL（高）血漿樣品，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，并與實際質量濃度對比，測得平均加樣回收率分別為87.61%、91.02%、93.27%，RSD 分別為4.56%、3.78%、2.87%。取1.0、4.0、8.0 μg/mL 血漿對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得大黃酚峰面積RSD 分別為2.11%、1.63%、1.02%，表明儀器精密度良好。取血漿樣品，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得峰面積RSD 為3.47%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。取0.05 μg/mL 血漿對照品溶液，空白血漿稀釋，按“2.8.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得定量限、檢測限分別為4、2 ng/mL。

2.8.5 結果分析 表5、圖6 顯示，與原料藥比較，白蛋白納米粒Tmax縮短（P ＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對生物利用度增加至4.02 倍。

表5 大黃酚主要藥動學參數（，n=6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for chrysophanol（，n=6）

注：與大黃酚比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖6 大黃酚血藥濃度-時間曲線（n=6）Fig.6 Plasma concentration-time curves for chrysophanol（n=6）

3 討論

體外釋藥結果表明，大黃酚白蛋白納米粒呈現緩釋特征，但體內藥動學發現其Tmax顯著提前，與文獻［12，15] 報道一致，其原因可能是納米粒可在較短時間內經消化道直接吸收進入血液循環［16]，而本實驗納米載體采用白蛋白，可能與機體血漿中的白蛋白發生快速交換［10]，從而加快藥物在血液中的釋放速度；也有觀點認為，藥物與白蛋白分子之間的作用力可能較弱，導致藥物在體內釋藥較快，最終使Tmax提前，也極大促進了藥物體內吸收［16-18]。

目前，已報道的大黃酚新型口服制劑有微囊［19]、包合物［20]等。本實驗制備的白蛋白納米粒口服生物利用度提高了4.02 倍，與其他納米制劑［6，8，21]相比，它不僅載體生物相容性更好，安全性更高，而且載體本身也可作為凍干保護劑，減少了輔料使用，降低了成本，同時無需表面活性劑或交聯劑。但該制劑也有不足之處，例如在制備過程中采用有毒試劑二氯甲烷；雖然藥物水溶性有所提高，但其體外溶出仍較緩慢，而且脂溶性可能未得到改善，從而限制了其口服生物利用度的提高，今后將對此作進一步改進。