3種β缺失型地中海貧血基因型與表型分析

李育敏，蔡欽泉，覃俊龍，金 瀟，陳亞瓊，莫云均，李 悅，張秀明

（1.深圳市羅湖區人民醫院醫學檢驗科，廣東 深圳 518001；2.深圳市羅湖區人民醫院感染管理科，廣東 深圳 518001）

β地中海貧血（簡稱地貧）大部分由β珠蛋白基因點突變引起，少部分因基因缺失而導致[1]。β珠蛋白基因簇上的大片段DNA序列缺失常見于δβ地貧和遺傳性持續性胎兒血紅蛋白血癥（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）[1-2]。目前，有文獻報道的中國人群大片段β缺失型地貧至少有5種，其中3種屬于δβ地貧，包括中國型缺失、云南型缺失和廣州型缺失，均為Gγ（Aγδβ）0，另外2種分別為東南亞型-HPFH缺失和臺灣型缺失[1-2]。此外，有研究在中國人群中還發現了2種小片段β缺失合并β點突變，分別為CD89-93（-14bp）合并-28和CD54-58（-13bp）合并IVS-Ⅱ-654[3]。我國南方地區以中國型Gγ+（Aγδβ）0和東南亞型-HPFH[4-5]多見，其他β缺失型地貧的相關報道較少。由于我國大部分醫院采用的地貧基因診斷試劑盒僅能檢測常見的β基因點突變類型，較為少見的β基因缺失尚需通過其他方法進行檢測，如臨床對β缺失型地貧血液學特征不熟悉，則易漏診該類地貧。本研究針對深圳市羅湖區人民醫院近年來發現的中國型Gγ+（Aγδβ）0、東南亞型-HPFH和臺灣型β地貧及其合并其他類型地貧時的血液學表型進行分析，為罕見β地貧的篩查和臨床遺傳咨詢提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年6月—2019年5月深圳市羅湖區人民醫院接受血紅蛋白（hemoglobin，Hb）電泳檢測的門診和住院患者72 397例。采集HbF≥5%、年齡≥6個月患者的外周靜脈全血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，2～8 ℃保存，用于紅細胞參數檢測、Hb電泳檢測、地貧基因檢測和DNA測序。

1.2 儀器與試劑

Hb電泳檢測采用Capillarys2全自動毛細管電泳儀（法國Sebia公司）。紅細胞參數檢測采用XN-1000血細胞分析儀及配套試劑（日本Sysmex公司）。地貧基因檢測采用Hema T960 PCR擴增儀（珠海黑馬公司）、ChemiDoc MP全自動凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）、DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）、YNH16恒溫雜交儀及配套試劑（深圳亞能公司）。DNA測序采用3730XL遺傳分析儀（美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 血液學分析 采用毛細管電泳法進行Hb電泳檢測，電泳圖分為Z1～Z15區，分區鑒別Hb條帶類型，并分析各條帶所占比例，主要觀察HbF帶和HbA2帶。紅細胞參數主要觀察Hb、紅細胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）和平均紅細胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）。嚴格按儀器和試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 地貧基因檢測 采用聚合酶鏈反應-反向斑點雜交法檢測3種α地貧缺失型基因（--SEA、-α3.7和-α4.2）、3種α地貧非缺失型基因（αQS、αCS、αWS）和17種β地貧基因點突變類型（-28、-29、CD17、CD41-42、CD43、βE、CD71-72、IVS-Ⅱ-654、-32、-30、CAP、Initiation condon、CD14-15、CD27-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CD31）。采用跨越斷裂點-聚合酶鏈反應檢測中國型Gγ+（Aγδβ）0、東南亞型-HPFH和臺灣型β缺失型地貧。所有檢測和結果判讀均按試劑盒說明書要求進行。

1.3.3 DNA測序 DNA測序由深圳亞能公司完成。采用聚合酶鏈反應擴增Hb電泳檢測結果異常樣本α1、α2和β珠蛋白基因[6]。采用Sanger雙脫氧鏈終止法檢測珠蛋白基因序列。通過Vector NET 8.0軟件比對測序結果，運用人類異常血紅蛋白和地中海貧血數據庫（http：//globin.bx.psu.edu）查找突變位點。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因型檢測結果

檢出19例中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧患者，攜帶率為0.026%（19/72 397），其中2例為中國型Gγ+（Aγδβ）0復合-α3.7缺失雜合子、1例為中國型Gγ+（Aγδβ）0復合βE突變；檢出18例東南亞型-HPFH地貧患者，攜帶率為0.025%（18/72 397），其中4例為東南亞型-HPFH復合--SEA缺失雜合子；檢出3例臺灣型地貧患者，攜帶率為0.004%（3/72 397）。見表1。

表1 β缺失型地貧的基因型與血液學表型檢測結果

續表1

2.2 血液學表型檢測結果

單純中國型Gγ+（Aγδβ）0雜合子、單純東南亞型-HPFH雜合子和單純臺灣型雜合子地貧患者MCV和MCH水平均降低，HbF水平均升高。單純中國型Gγ+（Aγδβ）0雜合子和單純東南亞型-HPFH雜合子地貧患者Hb水平均正常，單純臺灣型雜合子地貧患者Hb水平稍有下降。單純中國型Gγ+（Aγδβ）0雜合子地貧患者HbA2水平正常，單純東南亞型-HPFH雜合子地貧患者HbA2水平正常或升高，單純臺灣型雜合子地貧患者HbA2水平升高。見表1。

3種地貧患者MCV、MCH、HbF、HbA2水平差異均有統計學意義（P=0.000），見表2。單純β缺失雜合子與合并其他類型地貧MCV、MCH、HbF、HbA2比較結果見表3。

表2 3種單純β缺失雜合子地貧的血液學參數比較

表2 3種單純β缺失雜合子地貧的血液學參數比較

注：*與中國型Gγ+（Aγδβ）0比較，*P＜0.05；與東南亞型-HPFH比較，#P＜0.05。

基因型 MCV/fL MCH/pg HbA2/% HbF/%中國型Gγ+（Aγδβ）0 69.1±2.2 22.7±1.1 2.5±0.2 15.4±2.6東南亞型-HPFH 75.0±5.3* 25.5±1.8* 3.9±0.8* 23.8±5.2*臺灣型 64.7±4.1# 20.2±2.1# 6.4±1.1*# 8.0±2.4*#P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 單純β缺失雜合子與合并其他類型地貧血液學參數 x±s

3 討論

β珠蛋白基因簇的5個功能基因按照5'→3'的順序分別為ε-Gγ-Aγ-δ-β，其大片段缺失累及δ和β基因引起的地貧被稱為δβ地貧，按照分子缺陷和表型特征可分為GγAγ（δβ）0-地貧、Gγ（Aγδβ）0-地貧、（εγδβ）0-地貧和Hb Lepore[7]。此外，β基因簇大片段缺失還可導致HPFH，即成人體內持續存在過量的胎兒HbF。根據基因缺陷不同，HPFH可分為缺失型和非缺失型兩大類，前者根據發現人群、缺失片段的大小和位置，可分為HPFH-1型～7型和French、French West-Indies和Algeria β缺失[8-9]。在中國人群中最常見的是中國型Gγ+（Aγδβ）0和HPFH-6型（東南亞型-HPFH），HPFH-6型是我國目前唯一發現的HPFH類型，缺失范圍累及β基因和3'-HS-1區域，缺失長度為27 kb[4，8]，而前者缺失范圍累及部分Aγ、全部δ基因、β基因和3'-HS-1區域，缺失長度為78.9 kb。本研究結果顯示，中國型Gγ+（Aγδβ）0與東南亞型-HPFH在深圳地區β缺失型地貧中占多數，攜帶率分別為0.026%和0.025%。另外，本研究還發現3例臺灣型，該缺失于2008年由HUANG等[10]首先在中國臺灣地區發現，后在中國大陸人群中也有個例報道[11]，其缺失長度為1 357 bp，5'端斷裂點落在β基因的Cap位點（位于-548），3'端斷裂點落在β基因的IVS-Ⅱ位點（位于+810）。

γ珠蛋白基因因在患兒出生前后關閉而迅速減少，HbF（α2γ2）在患兒6個月時一般不超過5%，1歲時一般不超過1%[1]。β缺失導致HbF水平升高的機制尚不完全清楚，有學者認為該機制可能為β基因簇上多個參與基因表達調控的元件失控，影響了γ基因的發育開關轉換，導致患兒出生后HbF水平持續升高，使得γ基因替代β基因功能，從而緩解了α與β肽鏈的不平衡[8，12]。β基因簇中有2個表達γ鏈的基因，即Gγ和Aγ，因此組成HbF的為Gγ和Aγ鏈，≥1歲患兒Gγ和Aγ的含量比為40%∶60%。中國型Gγ+（Aγδβ）0和東南亞型-HPFH由于缺失的分子基礎不同，HbF以及Gγ和Aγ的含量均存在差異。東南亞型-HPFH的HbF水平通常較中國型Gγ+（Aγδβ）0更高，其雜合子可高達29%[4]，這可能與Gγ和Aγ導致HbF水平升高的機制有關[8，12]。東南亞型-HPFH的HbF水平升高的機制主要為：（1）缺失高敏位點3'-HS-1后，失去對γ基因表達的抑制，導致γ基因僅受上游5'端基因座控制區（locus control region，LCR）的正調控，同時又缺失了β基因的競爭作用；（2）缺失使3'端下游的增強子更靠近γ基因而產生較強的正效應，即增強子距離效應；（3）缺失γ基因沉默子，使本應關閉的γ基因持續表達[8，12]。然而，中國型Gγ+（Aγδβ）0缺失還涉及到部分Aγ和鄰近Aγ基因3'端的增強子，這可能是導致Gγ和Aγ表型差異的主要原因[8，12]。另外，中國型Gγ+（Aγδβ）0的斷點位于Aγ基因的 IVS-Ⅱ，保留了完整的Gγ基因，因此其HbF的Aγ含量明顯減少，Gγ含量可高達72%～100%，而東南亞型-HPFH的Gγ含量僅略高于正常值，為57%～63%[12]。

本研究選取年齡≥6個月、HbF≥5%的患者進行中國型Gγ+（Aγδβ）0、東南亞型-HPFH和臺灣型3種罕見β缺失型地貧檢測，結果顯示，3種地貧單純缺失雜合子以東南亞型-HPFH的HbF水平最高，中國型Gγ+（Aγδβ）0次之，臺灣型最低；而HbA2水平以臺灣型最高，東南亞型-HPFH次之，中國型Gγ+（Aγδβ）0最低；3種地貧患者HbF和HbA2水平差異均有統計學意義（P＜0.05）。此外，3種地貧患者MCV和MCH水平差異也均有統計學意義（P＜0.05）。但當兩兩比較時，東南亞型-HPFH較其他2種地貧更高（P＜0.05），而中國型Gγ+（Aγδβ）0和臺灣型差異無統計學意義（P＞0.05） ，這與杜麗等[4]的研究結果相符。臺灣型地貧的HbA2在3種地貧中最高，為（6.4±1.1）%；HbF最低，為（8.0±2.4）%。機制可能與缺失的分子基礎有關，其缺失長度在3種地貧中最短，范圍累及β基因的啟動子至IVS-Ⅱ，不包括第三外顯子和3'端非翻譯區，因此其血液學表型更類似β基因點突變。

中國型Gγ+（Aγδβ）0與其復合-α3.7缺失雜合子相比，血液學參數差異無統計學意義（P＞0.05）；中國型Gγ+（Aγδβ）0復合βE的MCV和MCH均較單純雜合子低，而HbF水平升高，無HbA；東南亞型-HPFH與其復合--SEA缺失雜合子相比，僅MCH存在差異，但后者的MCV和HbF均較前者更低，可能需要更多樣本來進行統計分析。通常情況下，β缺失復合α地貧，α基因和β基因表達均減少，使α鏈和β鏈合成相對平衡，臨床多表現為輕型地貧，但是也存在異質性[4]；而β缺失復合β地貧，2種突變均位于β基因上，導致β鏈合成更低或不合成，α鏈主要合成HbF和HbA2，而無HbA或僅少量HbA形成，臨床表現為中間型或重型地貧[4]，表明單純β缺失雜合子與復合其他類型地貧的表型差異主要與其合并的地貧類型有關。鑒于成年男性和女性的Hb參考區間不同，本研究按性別分別統計了各β缺失型地貧患者的血液學參數，分析了MCV、MCH、HbF和HbA2指標的差異，而未進行Hb的比較。

綜上所述，3種β缺失型地貧均以HbF升高為特征，臨床應注意鑒別其血液學表型，并進行地貧基因檢測以明確基因型。另外，HbF水平升高還可見于非缺失型HPFH 和δβ地貧，以及妊娠和骨髓惡性腫瘤等[12-14]，臨床應注意區分其原因，以避免漏診和誤診。