基于網絡藥理學探討“金銀花-玄參”藥對治療動脈粥樣硬化的分子機制

王淑琪 孫克寒 陳 菲 高 照 林繄依 楊漫芳 許心蕊 聶 波

1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029；2.北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部重點實驗室北京中醫藥大學東直門醫院北京市重點實驗室，北京 l00700；3.北京中醫藥大學東直門醫院后勤保障處，北京 100700

動脈粥樣硬化（AS）是由于動脈壁上的脂質沉積，使動脈管腔形成斑塊并變窄的病變，是導致心腦血管疾病的危險因素之一，對人體健康具有巨大威脅[1]?，F代研究發現，多種中藥如黃連、黃芩、金銀花、甘草、丹參、玄參、當歸等[2-5]均具有抗AS 的作用。中藥藥對的有效配伍可發揮增效減毒的作用，其中“金銀花-玄參”作為四妙勇安湯中的君藥和臣藥，在復方中用量較大，對抗AS 具有顯著作用[6]。金銀花乃甘寒之品，為疏散風熱、清熱解毒之要藥；玄參性微寒，為清熱涼血、滋陰降火、解毒散結之要藥[7-8]。此藥對具有抗炎、抗氧化、降血壓、擴張冠狀動脈、改善AS 等藥理作用，主要的化學成分包括環烯醚萜類、苯丙素苷類、有機酸類、黃酮類等[9-10]。

本文中的網絡藥理學研究是借助數據庫和文獻資料及前期課題實驗研究[11-12]，利用大量的生物學信息，對現有的分子生物學數據進行分析，從多方面闡釋中藥的活性成分與疾病之間的交互作用，為多成分、多靶點、多通路的中藥作用機制研究和藥效物質研究提供依據[13]。因此，本研究通過構建“金銀花-玄參”藥對的“藥物-成分-疾病-靶標-信號通路”交互關系網絡，并結合GO 生物過程分析及KEGG 通路富集分析，開展“金銀花-玄參”藥對治療AS 的分子作用機制研究。

1 資料與方法

1.1 靶標網絡的構建

1.1.1 活性成分和作用靶點的篩選及活性成分-靶點的構建 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）[14]檢索金銀花、玄參中的化學成分，以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性指數（DL）≥0.18 作為篩選條件[15-16]。除此之外，通過查閱文獻，篩選金銀花和玄參中因上述篩選條件而被刪除的但對抗AS 的研究有一定藥理活性的化學成分。同樣基于TCMSP平臺，通過檢索獲得藥對中活性成分所作用的靶標。將上述金銀花-玄參各藥物的活性成分及藥物潛在靶點，利用Cytoscape 3.7.0 軟件進行活性成分-靶點網絡的構建。

1.1.2 疾病相關靶點的篩選 通過DisGeNET[17]、OMIM[18]、GeneCards[19]數據庫進行檢索，獲得AS 相關的疾病靶點，將獲得的疾病靶點與“金銀花-玄參”有效成分的靶標進行比對取交集，得到“金銀花-玄參”藥對治療AS 的作用靶點用于后續的研究。

1.1.3 藥物靶點與疾病靶點標準化及交互關系構建將上述獲得的藥物與疾病相關靶點名稱上傳到Uniprot 數據庫，獲得靶點的標準基因名稱。利用Venny 2.1 軟件將藥物靶點和疾病靶點進行交集分析，再用String 11.0 平臺將交集分析后篩選到的共有靶標建立藥物靶點-疾病靶點交互作用關系，數據導入Cytoscape 軟件進行分析。

1.1.4 PPI 網絡的拓撲分析和核心靶點的篩選 利用Cytoscape 軟件中的BisoGenet、CytoNCA 和CytoHubba 插件對上述得到的PPI 網絡進行拓撲分析，通過調節degree 下限值至合適的數值篩選核心靶點，得到PPI網絡圖。

1.2 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

將上述篩選出的PPI 網絡核心靶標導入David 6.8 數據庫中，進行GO 生物過程的富集分析及KEGG通路分析，以P ≤0.01 作為篩選條件并從小到大排序。選取符合條件的GO 生物過程及KEGG 通路，并上傳至Sanger box 云平臺，進行數據可視化處理。

1.3 活性成分-AS 靶點-KEGG 通路PPI 網絡構建

從以上步驟中得到參與抗AS 的前20 條KEGG通路后，與“金銀花-玄參”活性成分、藥物及疾病共有靶點一起上傳至Cytoscape 3.7.0 軟件，得到“金銀花-玄參”藥物成分-藥物靶點-AS 靶點-信號通路多維網絡關系圖。

2 結果

2.1 活性成分及藥物-成分-靶點網絡構建

經TCMSP 數據庫篩選，從“金銀花-玄參”藥對中獲得相關化合物283 個，經篩選、去重共得到37 個活性成分，見表1（由于結果過多，只展示其中部分結果）。37 個活性化合篩選出231 個相關靶點，見表2（由于結果過多，只展示其中部分結果）。利用Cytoscape 3.7.0 軟件進行分析，可得到“金銀花-玄參”藥對的“中藥-成分-靶點”網絡圖共得到259 個節點，方形代表兩種中藥，菱形代表藥物活性成分，圓形代表藥物作用，見圖1。

圖1 “金銀花-玄參”藥對的“中藥-活性成分-作用靶點”網絡

表1 “金銀花-玄參”的主要活性成分

表2 “金銀花-玄參”部分作用靶點基本信息

2.2 疾病靶點的篩選

利用數據庫對AS 進行檢索，經去重后共獲得4410 個AS 相關的疾病靶點，包括載脂蛋白E、花生四烯酸5-脂氧合酶、C 反應蛋白等。

2.3 藥物及疾病靶點標準化及共有靶點PPI 網絡構建

靶點基因標準化后，利用Venny 2.1 軟件繪制韋恩圖，得到藥物成分-疾病共同靶點173 個，主要包括誘導型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子（TNF）、γ 干擾素、白細胞介素（IL）-6 等。見圖2。

圖2 “金銀花-玄參”藥物成分-疾病靶點韋恩圖

2.4 PPI 網絡的拓撲及核心靶點的篩選

將這173 個靶蛋白基因名上傳至String 平臺，并利用Cytoscape 軟件繪制得到聯系緊密的PPI 網絡圖，見圖3。不同顏色的靶標代表藥物成分與AS 靶標之間的密切程度，顏色越深代表聯系越密切。分析可得絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、轉錄因子AP-1（JUN）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、TNF 等29 個核心靶蛋白。

圖3 “金銀花-玄參”成分抗動脈粥樣硬化相關靶點PPI 網絡

2.5 GO 生物過程和KEGG 通路富集分析

將“2.4 項”核心靶蛋白基因上傳到David 6.8 數據庫，進行GO 生物過程及KEGG 信號通路的富集分析。共得到348 個GO 條目、102 個KEGG 條目，據條件可確定49 個GO 條目，主要包括酶結合、轉錄因子結合、核質蛋白等生物分析過程，見圖4。同樣篩選條件，共獲得55 條信號通路，主要包括癌癥相關通路、乙型肝炎通路、胰腺癌通路等，信號通路可視化結果見圖5。

圖4 “金銀花-玄參”調控動脈粥樣硬化的關鍵靶蛋白GO 生物過程可視化（前20）

圖5 “金銀花-玄參”調控動脈粥樣硬化的關鍵靶蛋白KEGG 信號通路可視化（前20）

2.6 網絡拓撲圖構建

將“金銀花-玄參”中藥-活性成分-作用靶點網絡、“金銀花-玄參”藥對抗AS 關鍵靶點和上述可能參與到AS 疾病過程的KEGG 信號通路，利用Cytoscape軟件得到“金銀花-玄參”藥物成分-藥物靶點-AS 靶點-信號通路多維網絡圖，共199 個節點，其中24 個藥物成分（菱形節點）、20 個信號通路（三角節點）、155 個相關靶點（圓形節點），見圖6。

圖6 “金銀花-玄參”藥物成分-藥物靶點-動脈粥樣硬化靶點-信號通路網絡

3 討論

AS 的發病機制復雜，可能涉及多種發病因素，其中脂質沉積和血管內皮損傷是公認的AS 發病的初始過程[20]。金銀花、玄參兩種中藥在臨床中使用廣泛，有多種重要的藥理作用，且作為四妙勇安湯的君臣藥，對AS 具有一定的治療和改善作用，但君臣藥對研究抗AS 的確切靶點還鮮有報道。因此，本研究利用網絡藥理學研究方法，同時結合文獻資料和前期課題組實驗研究結果，從微觀角度分析“金銀花-玄參”藥對活性成分及其對AS 的作用機制。

從上述網絡藥理學分析結果可知，MAPK1、JUN、TP53、TNF 可能是“金銀花-玄參”治療AS 的核心靶點。MAPK1 在受到細胞應激的刺激下被激活，在調節細胞的生長、分化、炎癥反應等多種重要的細胞生理、病理過程中起到重要作用[21]。JUN 通過抑制轉錄和表達對減輕炎癥反應、組織損傷等疾病具有重要意義[22]。TP53 作為重要的腫瘤抑制因子之一[23]，廣泛參與到調控細胞凋亡過程。TNF 又稱為惡液質素，主要由巨噬細胞分泌，參與調節廣泛的生物學過程，包括脂質代謝、凝血和細胞凋亡等[24]。

本研究發現，MAPK1、JUN、TP53、TNF 等基因主要富集于TNF 信號通路、MAPK 信號通路和Toll 樣受體信號通路。TNF 信號通路是凋亡相關的經典信號通路，AS 病變過程中巨噬細胞產生炎癥因子及脂類介質，與TNF-α、IL-1β 的表達呈相關性[25]。MAPK 信號通路是研究中藥抗AS 炎癥機制研究的熱點通路，通過抑制MAPK 信號通路的激活來抑制白細胞與血管內皮細胞的黏附，抑制炎癥反應[26]。Toll 樣受體參與到AS 炎癥反應、脂質調控及斑塊形成等過程，對抗AS 發揮重要作用[27]。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學的研究方法對“金銀花-玄參”藥對配伍抗AS 的潛在分子作用機制進行全面的預測和分析，發現“金銀花-玄參”中的槲皮素、木犀草素、山柰酚等成分直接作用于MAPK1、JUN、TP53、TNF 等相關靶點發揮作用，并可能通過MAPK 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路等抑制炎癥反應，保護血管內皮細胞，促進膽固醇的逆轉運和代謝，抑制AS 的病理發展過程，體現了中醫藥多藥物、多成分、多靶點、多通路共同發揮作用的特點。本課題組也將進一步探索“中藥多組分-生物信息學-多靶點多通路作用-實驗驗證”的研究模式，為研究中藥藥效物質及其作用機制研究提供快速精準的研究策略。