微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞功能的影響及其機制研究

李曉青 李建州 楊 英 李蘭娟

1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院急診科，陜西西安 710061；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院感染科，陜西西安 710061；3.浙江大學傳染病診治國家重點實驗室，浙江杭州 310003

人工肝支持系統(tǒng)是目前臨床治療肝衰竭的最重要手段之一，而以培養(yǎng)肝細胞為基礎的生物人工肝（bioartificial liver，BAL）是其中的研究熱點[1-3]。BAL 理論上可以完全替代肝臟的合成、代謝解毒等生物學功能，國內(nèi)外已有多個BAL 系統(tǒng)進入臨床試驗階段，但初步的研究結果并不理想，其核心問題是無法獲得足夠數(shù)量的高活性、功能良好的肝細胞[4-6]。肝細胞是BAL 的核心成分，BAL 對肝衰竭的治療作用主要取決于反應器中的肝細胞。但肝細胞在常規(guī)的二維培養(yǎng)方式下呈平面生長，不利于維持其增殖活性和生物學功能，無法滿足BAL 對細胞源的要求。而三維培養(yǎng)技術能夠為肝細胞提供類似于肝小葉的微環(huán)境，顯著提高細胞的增殖、分化和活性，有力地彌補了二維培養(yǎng)的不足[7-9]。本研究擬采用海藻酸鈣微囊制備技術，構建一套微囊流化培養(yǎng)系統(tǒng)，探討微囊流化培養(yǎng)對C3A細胞功能的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗用細胞系及主要試劑

C3A 細胞系購自美國標準生物品收藏中心；高糖DMEM 培養(yǎng)基（貨號：11995065）、胎牛血清（貨號：10099-141）購自美國Gibco 公司；制作微囊應用海藻酸鈉（貨號：A2033）購自美國Sigma-Aldrich 公司；制作破囊液用檸檬酸三鈉（貨號：10019418）購自上海國藥集團化學試劑有限公司；FDA（貨號：F1303）、PI（貨號：P3566）熒光染料購自美國Invitrogen 公司；MTT 試劑盒（貨號：11465007001）購自瑞士Roche 公司；白蛋白定量試劑盒（貨號：E80-129）購自美國Bethyl Laboratories 公司；尿素定量試劑盒（貨號：EUR3-100）購自美國BioAssay System 公司；Trizol 試劑（貨號：A33250）購自美國Invitrogen 公司；CYP3A4 活性定量試劑盒（貨號：V9002）、CYP1A2 活性定量試劑盒（貨號：V8752）購自美國Promega 公司；熒光定量PCR試劑盒（貨號：DRR036A）購自日本TaKaRa 生物株式會社；CYP1A2（貨號：ab56073）、CYP2E1（貨號：ab53945）、CYP3A4（貨號：ab124921）、CYP3A5（貨號：ab108624）一抗抗體購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）（貨號：4782S）、p-PKA（貨號：5661S）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）（貨號：2056S）、p-PKC（貨號：9371S）一抗抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）（貨號：C6974）一抗抗體購自美國Sigma-Aldrich 公司；辣根過氧化物酶標記二抗（貨號：BA1051）購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 C3A 細胞的微囊化

置于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的C3A 細胞收獲后與海藻酸鈉溶液充分混勻，細胞密度為3×106/mL，采用層流噴射分離法制備海藻酸鈣微囊[10]：先用50 mL 注射器吸入混勻后的C3A 細胞懸液，通過導管連接微囊制備儀器（Nisco，LJB-5），調(diào)整機器參數(shù)使C3A 細胞懸液形成穩(wěn)定的大小均勻的海藻酸鈉液滴，滴入4℃的氯化鈣溶液中，反應形成海藻酸鈣微囊，微囊在氯化鈣溶液中固化10 min，用4℃的生理鹽水將包裹有C3A 細胞的海藻酸鈣微囊洗滌3 遍后放置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.3 實驗分組

二維培養(yǎng)組：C3A 細胞直接接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。微囊靜態(tài)培養(yǎng)組：將C3A 細胞微囊于培養(yǎng)皿中靜態(tài)培養(yǎng)。微囊流化培養(yǎng)組：將C3A 細胞微囊置于流化床式反應器（ZL 200710070279.0）中，與儲液池相連，由蠕動泵以80 mL/min 的速度提供循環(huán)動力，反應器入口及出口均有篩網(wǎng)防止微囊流出，微囊在反應器內(nèi)上下循環(huán)運動。3 種培養(yǎng)模式均用DMEM（含10%胎牛血清）培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 FDA/PI 熒光雙染法檢測海藻酸鈣微囊內(nèi)C3A細胞的活性 取適量包裹C3A 細胞的微囊于24 孔板中，用PBS 洗滌后加入FDA 及PI 染料使最終濃度分別為10 μmol/L 和20 μg/mL，37℃孵育5 min，使用磷酸鹽緩沖液洗滌后于熒光顯微鏡（賽默飛，M5000）下觀察，拍照，綠色熒光標記為活細胞，紅色熒光標記為死細胞。

1.4.2 肝細胞合成與代謝能力檢測 將3 種模式培養(yǎng)下的C3A 細胞或細胞微囊接種于12 孔板上，設置3 個復孔，培養(yǎng)24 h，留取上清液按試劑盒說明書分別進行白蛋白、尿素含量的檢測。按試劑盒說明書分別進行CYP1A2、CYP3A4 代謝活性的檢測，最終結果以培養(yǎng)孔細胞總蛋白標準化。

1.4.3 熒光定量PCR 檢測 采用Trizol 法提取肝組織的總RNA，逆轉錄成cDNA，應用ABI 7500 熒光定量PCR 儀（型號：QuantStudio 6）進行反應，反應體系為cDNA 4 μL、上游及下游引物各0.4 μL、定量PCR 預混液10.0 μL、超純水5.2 μL，實驗反應條件為50°C 2 min，95°C 10 min，95°C 30 s，60°C 30 s，40 循環(huán)，以2-△△Ct進行分析。PCR 引物序列如下：GAPDH 上游引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；CYP2B6 上游引物序列為5’-TCTGGCCGGGGAAAAATCG-3’，下游引物序列為5’-GGTCACAGAGAATCGCCGAAG-3’；CYP2E1 上游引物序列為5’-GATGCCCTACATGGATGCTG-3’，下游引物序列為5’-AAATGGTGTCTCGGGTTGCT-3’；CYP3A4 上游引物序列為5’-AG-ATGCCTTTAGGTCCAATGGG-3’，下游引物序列為5’-GCTGGAGATAGCAATGTTCGT-3’；CYP1A2上游引物序列為5’-CTGGGCACTTCGACCCTTAC-3’，下游引物序列為5’-TCTCATCGCTACTCTCAGGGA-3’；UGT2B4 上游引物序列為5’-CAAATGTTGAGTTCGTTGGAGGA-3’，下游引物序列為5’-CTGACGTGTTACTGACCATCG-3’。

1.4.4 Western blot 蛋白印跡分析 取3 種培養(yǎng)模式下的C3A 細胞（細胞微囊破囊后離心收獲細胞）按常規(guī)步驟提取總蛋白、測定蛋白濃度，后進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗等步驟。用ECL 液顯色檢測蛋白信號，用BandScan圖像分析軟件分析各陽性條帶的積分灰度值，分別計算CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、PKA、p-PKA、PKC、p-PKC、CaM 與內(nèi)參β-actin 的灰度值之比作為其蛋白相對含量值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞活性的影響

C3A 細胞微囊包裹后培養(yǎng)24 h，在倒置相差顯微鏡下觀察，微囊流化培養(yǎng)組微囊結構完整，未見明顯破碎。熒光染色結果顯示FDA 染色呈綠色熒光，微囊內(nèi)細胞C3A 活性良好，PI 染色未見明顯紅色熒光，即未見明顯壞死細胞。見圖1。

圖1 微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞活性的影響（FDA/PI 熒光雙染）

2.2 微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞合成及代謝功能的影響

微囊靜態(tài)及微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞的白蛋白、尿素合成能力和CYP1A2、CYP3A4 代謝活性均高于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞的白蛋白、尿素合成能力及CYP1A2 代謝活性均高于微囊靜態(tài)培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞的CYP3A4 代謝活性與微囊靜態(tài)培養(yǎng)組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖2。

圖2 微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞功能的影響

2.3 微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞代謝相關功能基因mRNA 表達的影響

微囊靜態(tài)及微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞的CYP1A2、CYP2B62、CYP2E1、CYP3A4、UGT2B4 基因mRNA 的表達水平均高于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞CYP1A2、CYP2E1、UGT2B4 基因mRNA 的表達水平均高于微囊靜態(tài)培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見圖3。

圖3 微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞功能基因mRNA 表達的影響

2.4 微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞代謝相關功能基因蛋白表達的影響

微囊靜態(tài)及微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5 基因蛋白的表達水平均高于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；微囊靜態(tài)培養(yǎng)組CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5基因蛋白的表達水平與微囊流化培養(yǎng)組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖4。

圖4 微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞功能基因蛋白表達的影響

2.5 微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞代謝相關信號通路的影響

微囊靜態(tài)及微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞p-PKC、CaM 的表達低于二維培養(yǎng)組，PKA 蛋白的表達水平高于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；微囊靜態(tài)培養(yǎng)組C3A 細胞p-PKA 的表達高于二維培養(yǎng)組，微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞p-PKA 的表達低于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞p-PKC、p-PKA、CaM 的表達水平均低于微囊靜態(tài)培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。三組PKC 蛋白的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖5。

圖5 微囊流化培養(yǎng)對C3A 細胞代謝相關信號通路關鍵分子的影響

3 討論

肝細胞體外培養(yǎng)如何能長時間維持其活性及生物學功能，是目前制約BAL 研究關鍵問題之一[11-12]。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式比較，BAL 所需的肝細胞的培養(yǎng)方式對于規(guī)模、時間及是否使用生物基質(zhì)等方面的要求較高，同時還需考慮到BAL 臨床應用的實用性[13]。三維培養(yǎng)是將不同生物材料的載體與細胞在體外共同培養(yǎng)，能夠最大程度地模擬體內(nèi)生理環(huán)境，為解決上述問題提供了有效途徑。多種三維培養(yǎng)技術如凝膠包裹培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微重力培養(yǎng)等已被廣泛應用到BAL 的研究中，顯著提高了肝細胞培養(yǎng)的規(guī)模和質(zhì)量[14-20]。而微囊化培養(yǎng)與其他三維培養(yǎng)技術比較，物質(zhì)交換效率更高，培養(yǎng)密度更大且易于凍存、運輸，在BAL 研究中具有較好的應用前景[21-23]。

本研究采用流化床式生物反應器，并裝載了微囊包裹的C3A 細胞，結合儲液池、蠕動泵等裝置，構建了一套三維動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)。研究結果顯示，包裹細胞后的海藻酸鈣微囊在24 h 的流化過程后仍能保持良好的完整性和機械強度，微囊內(nèi)C3A 細胞的活性與靜態(tài)培養(yǎng)比較，差異無統(tǒng)計學意義。在功能評價上，與二維培養(yǎng)組比較，微囊靜態(tài)培養(yǎng)、微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞的合成能力及代謝活性均顯著提高，其中微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞的功能最佳，提示微囊流化培養(yǎng)是一種有效可行的三維動態(tài)培養(yǎng)模式。

在臨床治療上，BAL 的合成功能可以通過外源性補充白蛋白、血漿等來解決，代謝解毒功能才是BAL發(fā)揮作用的關鍵。CYP450 是主要分布于肝微粒體的藥物主要Ⅰ相代謝酶，參與脂肪酸、類花生四烯酸等多種內(nèi)源性物質(zhì)及藥物、毒物等外源性化合物的代謝，與肝臟的代謝解毒功能密切相關[24-25]。在本研究中，微囊化培養(yǎng)后主要的藥物代謝酶CYP1A2、CYP3A4代謝活性均明顯升高，熒光定量PCR 的檢測結果顯示CYP2B62、CYP2E1 及Ⅱ相酶UGT2B4 的表達水平同樣顯著升高，而微囊流化培養(yǎng)組相關基因表達的上調(diào)則更加顯著。但是在蛋白表達層面，微囊靜態(tài)培養(yǎng)與微囊流化培養(yǎng)比較，差異無統(tǒng)計學意義。為了探究產(chǎn)生這種差異的內(nèi)在機制，本研究對與CYP450 酶活性相關信號通路的關鍵分子進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)與微囊靜態(tài)培養(yǎng)組比較，微囊流化培養(yǎng)組C3A 細胞的p-PKC、p-PKA、CaM 蛋白的表達水平明顯下降，因此推測微囊流化培養(yǎng)可能通過下調(diào)PKC、PKA 的磷酸化及CaM 的水平，促進CYP450 酶活性的增強，但是其具體分子機制還需進一步的研究。

綜上所述，微囊流化培養(yǎng)能夠顯著提高C3A 細胞的合成及代謝能力，為BAL 提供高活性、功能良好的種子細胞，其作用機制可能與下調(diào)相關信號通路蛋白的磷酸化及CaM 的水平有關。