不同檢測方法對妊娠晚期B族鏈球菌的篩查比較

樊春卉 金 嫻▲ 朱平安 譚 萍 張艮芳 黃曉彤 陳 芳

1.深圳市鹽田區人民醫院檢驗科，廣東深圳 518081；2.深圳市鹽田區人民醫院婦產科，廣東深圳 518081

B族鏈球菌（GBS）是孕婦圍生期感染中比較常見的病原菌，又叫無乳鏈球菌。目前全球范圍內GBS的檢出率有所差異，受地區、種族差異及檢測方法不一影響，檢出率在5%～30%[1-2]。直接接種細菌培養法對實驗條件沒有太高的要求，不少醫院均可以做到，但是檢出率較低，甚至會出現漏診的情況，對GBS治療造成一定的影響。有報道稱免疫層析法和實時熒光定量PCR法（以下簡稱“PCR法”）能快速檢測GBS，且有很高的檢測率[3-4]。本研究采用不同檢測方法對選擇性肉湯培養基增菌進行前后檢測，并統計分析各方法的檢測結果，為臨床不同GBS檢測需求提供合理的檢測方案，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月～2019年7月于深圳市鹽田區人民醫院接受產檢的702例妊娠晚期孕婦作為研究對象，年齡22～39歲，平均（28.3±3.9）歲；孕齡35.2～37.1周，平均（35.9±0.6）周。納入標準：35周≤孕齡＜38周；孕婦知情同意且簽署同意書。排除標準：1周內使用過抗菌藥或陰道周圍外用清洗劑的孕婦。本研究經深圳市鹽田區人民醫院醫學倫理委員會批準后開展。

1.2 試劑、儀器和方法

1.2.1 試劑和儀器 選擇性肉湯培養基（青島海博生物科技有限公司）；血平板（鄭州安圖生物工程有限公司）；細菌鑒定儀器（法國生物梅里埃公司，型號：VITEK2 COMPACT）；免疫層析試劑盒（北京金沃夫生物工程技術有限公司，批號20170801）；全自動熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司，型號：ViiA 7Dx）；GBS核酸檢測試劑盒、陰性和陽性對照試劑盒（中山大學達安基因有限公司，批號2018001）。

1.2.2 方法 ①采集標本：標本為研究對象陰道-直腸分泌物。②增菌培養：將樣品置于選擇性肉湯培養基中增菌，在濃度為5%～10%二氧化碳培養箱中培養18 h，溫度設置為35℃，本次操作方式實施無菌操作。③分離培養及鑒定：將增菌前的樣品及增菌液接種于血平板，依舊在濃度為5%～10%二氧化碳培養箱中培養18～24 h，溫度同樣設定為35℃。血平板上可疑的GBS菌落呈灰白色，表面光滑凸出，透光。疑似菌落生化鑒定：革蘭染色陽性，觸酶試驗陰性，CAMP試驗陽性，再上機鑒定為無乳鏈球菌。分別選擇無乳鏈球菌和化膿性鏈球菌的質控菌株作為陽性對照與陰性對照。④免疫層析法檢測：增菌前樣本和1 mL增菌液進行檢測，操作方式按照試劑盒要求實行。⑤PCR法檢測：增菌前樣本加入1 mL生理鹽水振蕩及增菌液1 mL離心后棄上清，再分別加入DNA提取液，100℃裂解10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液5 μL作為模板實施PCR擴增，其結果判定依據試劑盒說明書。

1.3 評價標準

金標準以增菌后的細菌培養法為準，對不同檢測方式的靈敏度、特異度、準確性和一致性實施分析比較。靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%，特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%，準確性=（真陽性+真陰性）/總例數×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；各組檢查實施相同性的Kappa檢驗，若Kappa＞0.6則存在較好的一致性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 直接接種細菌培養法與增菌細菌培養法檢測結果的比較

直接接種細菌培養法與增菌細菌培養法的檢測結果見表1。增菌后細菌培養法陽性檢出率為9.4%（66/702），直接接種細菌培養法陽性檢出率為2.8%（20/702），兩種檢測方法的陽性檢出率比較，差異有統計學意義（χ2=26.210，P=0.000）。直接接種細菌培養法的靈敏度為27.3%（18/66），特異度為99.7%（634/636），準確性為92.9%（652/702），一致性檢測Kappa=0.392。

表1 直接接種細菌培養法與增菌細菌培養法的檢測結果（例）

2.2 免疫層析法和增菌細菌培養法檢測結果的比較

免疫層析法與增菌細菌培養法的檢測結果見表2。增菌前和增菌后的免疫層析法陽性率分別為4.6%（32/702）、13.8%（97/702），免疫層析法增菌前后的陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=36.066，P=0.000）。增菌前免疫層析法檢測的靈敏度為36.4%（24/66），特異度為98.7%（628/636），準確性為92.9%（652/702），一致性檢測Kappa=0.456。增菌后免疫層析法檢測的靈敏度為80.3%（53/66），特異度為93.1%（592/636），準確性為91.9%（645/702），一致性檢測Kappa=0.606。免疫層析法增菌前后的靈敏度比較，差異有統計學意義（χ2=26.213，P=0.000）；免疫層析法增菌前后的特異度、準確性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 免疫層析法與增菌細菌培養法的檢測結果（例）

2.3 PCR法與增菌細菌培養法檢測結果的比較

PCR法與增菌細菌培養法的檢測結果見表3。增菌前和增菌后PCR法陽性率分別為8.5%（60/702）、12.5%（88/702），PCR法增菌前后的陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=5.922，P=0.015）。增菌前PCR法檢測的靈敏度為65.2%（43/66），特異度為97.3%（619/636），準確性為94.3%（662/702），一致性檢測Kappa=0.651。增菌后的靈敏度為87.9%（58/66），特異度為95.3%（606/636），準確性為94.6%（664/702），一致性檢測Kappa=0.724。PCR法增菌前后的靈敏度比較，差異有統計學意義（χ2=9.486，P=0.002）；PCR法增菌前后的特異度、準確性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 PCR法與增菌細菌培養法的檢測結果（例）

3 討論

我國于2010年出臺對GBS篩查指南，直接接種細菌培養法在各大醫院得到廣泛應用。但有文獻指出[5-6]，直接接種細菌培養法的陽性檢出率很低，導致有漏診情況的發生。近年來，國內醫院開始采用選擇性肉湯培養基進行細菌培養，許多研究表明，增菌后的細菌培養有很高的陽性檢出率[7-9]。此外有研究表明[10-11]，免疫層析法或PCR法在臨床中利于陽性檢出率的提高，對于臨床GBS篩查更適用。

本研究結合文獻對不同篩選方式進行探討，結果顯示，增菌后細菌培養法陽性檢出率高于直接接種細菌培養法，差異有統計學意義（P＜0.05），與相關文獻報道[12]相似，提示采用選擇性肉湯培養基可提高陽性檢出率。其主要原因是選擇性肉湯培養基中含有萘啶酸、黏菌素等抗菌藥物，能很好地抑制受試者陰道-直腸標本中非目標細菌的生長。此外，用免疫層析法和PCR法對增菌前后的樣品進行檢測，結果顯示，免疫層析法增菌前陽性率為4.6%，與顧向明等[13]研究結果（5.74%）相當；但增菌后免疫層析法陽性率為13.8%，顯著高于增菌前，差異有統計學意義（P＜0.05）。增菌前PCR法陽性率為8.5%，增菌后PCR法陽性率為12.5%，增菌后顯著高于增菌前，差異有統計學意義（P＜0.05）。以增菌后細菌培養法檢測為金標準，結果顯示，免疫層析法和PCR法在增菌后的檢測靈敏度高于增菌前檢測，差異有統計學意義（P＜0.05）；免疫層析法與PCR法增菌后的特異度與準確性與其增菌前比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。在一致性評價中，免疫層析法增菌前的Kappa值低于0.6，增菌后Kappa值高于0.6，提示增菌后免疫層析法的臨床可靠性更高。而增菌前后PCR法的Kappa值均高于0.6，且均高于免疫層析法，提示PCR法的可靠性略優于免疫層析法。考慮該兩種方法對于細菌培養法中GBS生長發育的狀況可以不予考慮，而且可以檢測出非β型溶血性GBS及CAMP陰性的B族鏈球菌，因此其陽性檢出率會更高。免疫層析法檢測比較方便易上手，專業技術要求低，檢測時間較短，靈敏度相對不高，但經過選擇性肉湯培養基增菌后可彌補其靈敏度較低的不足，適合基層醫院臨床初步檢測[14]。而PCR法相對有些復雜，但其靈敏度更高，一致性更好，不過要采用全自動熒光定量PCR儀，完成批量檢測的檢驗時間需要3 h，對于基層地區醫院來說，檢測要求較高，醫療條件較好的醫院推薦使用PCR法[15-16]。

綜上所述，選擇性肉湯培養基增菌后陽性檢出率更高，細菌培養法檢測準確但是耗時較長且對工作人員專業水平要求較高。增菌后的免疫層析法檢測方便快捷彌補了靈敏度相對較低容易出現假陰性的缺點，可作為基層醫院妊娠晚期GBS初步篩查方式。PCR法則具備靈敏度較高、一致性好且檢測耗時短、可批量操作的優點，優先推薦具備PCR檢測手段的醫院使用PCR法檢測。