胃癌組織中膜轉鐵蛋白及肽基脯氨酰順反異構酶的陽性表達率與臨床病理參數的關系

歐有冠，朱蕾，魯才杰

胃癌在惡性腫瘤中十分常見，其發生率和致死率在國內常見腫瘤中均排名第2位，對患者的健康和生命安全帶來極大的威脅和困擾[1]。根據2015年流行病學的統計數據，胃癌在國內年新發人數超過60萬，死亡人數高達40多萬，其發生率和致死率均排在了全部癌癥中的第2位，因大部分患者在診斷時已發生了轉移，5年生存率不到10%[2]。胃癌細胞的分裂增殖以及轉移機制當前還未定論，缺乏對胃癌預后的預測指標，對胃癌的療效影響十分嚴重[3]。相關研究發現，鐵對于腫瘤細胞的分裂增殖具有促進作用，大多數腫瘤均表現出鐵的供應量不足，一些可對鐵代謝異常進行調節的蛋白表達可顯著影響腫瘤細胞的分裂增殖及轉移[4]。鐵調素是近年來發現的一種蛋白質水解的中間產物，其可促進膜轉鐵蛋白(ferroportin,FPN)低表達和誘導其降解對鐵代謝異常進行調節，故推測FPN可能在鐵代謝中具有十分重要的調節作用。而肽基脯氨酰順反異構酶(peptidylprolyl cis-trans isomerase，PIN1)屬于高度保守且特異的磷酸化異構酶，高表達于大多數類型的腫瘤中[5]。本研究對30例胃癌患者的腫瘤組織標本與10例胃癌患者的癌旁正常胃黏膜組織中PIN1、FPN的表達水平進行了測定，分析了2者與胃癌患者臨床病理參數間的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集深圳市龍華區中心醫院2017年2月至2020年2月手術切除的30例胃癌患者的存檔胃部腫瘤組織蠟塊，均經病理學檢查確診。其中，男20例，女10例，中位年齡55歲；TNM分期符合2010年國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會(UICC/AJCC)TNM分期標準[6]，T1、T2期13例，T3、T4期17例；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移5例。另選取10例胃癌患者的癌旁正常胃黏膜組織作為對照。所有患者術前均未接受過放化療，所有標本均由2名專家進行確認。

1.2 方法 胃癌組織和正常胃黏膜組織標本均經40 g/L多聚甲醛固定、石蠟包埋以及4～6 μm連續切片。PIN1兔抗多克隆IgG抗體購自北京博爾西科技有限公司，使用稀釋液將抗體進行稀釋，稀釋度為1：50。免疫組化反應液、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。用PBS代替一抗作為空白對照，用購買的已知陽性切片作為陽性對照，操作嚴格按試劑盒說明書進行。所有組織經甲醛固定、石蠟包埋、蘇木素—伊紅染液(HE)染色后，在光學顯微鏡下相應找到其石蠟組織塊上已標記的腫瘤組織，制作成10×16組織陣列(每個標本取2個芯點，直徑1.6 mm)，共制作成3個蠟塊。正常胃黏膜組織取自距腫瘤≥7 cm的胃黏膜組織。PIN1蛋白陽性表達主要定位于胞質，顯示棕黃色為陽性。免疫組化反應結果判定方法：腫瘤組織或腺體組織超過芯片點的10%為有效病例。用同一標本癌組織陽性染色區域，進行不低于10個視野的觀察，結果以100個細胞計算染色強度指數(staining intensity index, SII)：<6%為(-)，6%～25%為(+)，26%～50%為(++)，>50%為(+++)；(+)～(+++)均計為陽性。

1.3 統計學處理 應用SPSS 22.0軟件進行統計分析，陽性表達率為計數資料，以百分比表示，行χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PIN1、FPN蛋白在正常胃黏膜與胃癌組織中的陽性表達率 FPN在正常胃黏膜組織中陽性表達率為80.0%(8例)，高于胃癌組織中的50.0%(15例)，差異有統計學意義(P<0.05)。PIN1在正常胃黏膜組織中陽性表達率為20.0%(2例)，低于胃癌組織中PIN1蛋白陽性表達率33.3%(10例)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 PIN1、FPN表達與胃癌組織臨床病理參數的關系 30例胃癌組織標本中按患者年齡、性別、臨床TNM分期分組中，PIN1蛋白陽性表達率比較差異均無統計學意義(P>0.05)；在腫瘤淋巴結轉移有無分組中，PIN1蛋白陽性表達率比較差異有統計學意義(P<0.05)。在胃癌TNM分期分組中，FPN蛋白陽性表達率比較差異有統計學意義(P<0.05)，在年齡、性別、有無腫瘤淋巴結轉移分組中，FPN蛋白陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 PIN1和FPN表達與胃癌組織臨床病理參數的關系[例(%)]

3 討論

PIN1是由人PIN1基因編碼的一種對有絲分裂進行調節的蛋白，主要存在于細胞核中，其中包括一個核定位信號(nuclear localization signal, NLS)以及2個功能區域，功能區域其中一個為N端的色氨酸-色氨酸中心區WW,另一個是C端的PIN1 PPlase活性區[7]。相比其他腫瘤標志物，PIN1可催化癌變[8]。PIN1具有的2個相互獨立結構區域，其中WW可與絲氨酸/蘇氨酸-脯氨酸(phosphor-Ser-Pro or phosphor-ThrPro, pSer/Thr-Pro)基序發生特異性結合，PIN1 PPlase活性區則可對底物異構產生催化作用。上述PIN1的2個獨立結構區域協同合作對底物順反異構產生催化作用，此種構象可對 PIN1多種底物蛋白的功能產生較大的影響。比如，真核細胞有絲分裂的關鍵激酶 Polo樣蛋白質激酶1(polo-like kinase1,PLK1)和周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)以及2種酶的底物均與PIN1產生作用，通過這些作用，PIN1可對有絲分裂的時空產生影響。與pSer/Thr-Pro結構區域相結合，可改變磷酸化蛋白的構象，從而對其功能和穩定性產生影響[9]。

PIN1陽性表達于大量的腫瘤細胞質、細胞核，均呈現出不同的染色情況。本研究中在胃癌組織中PIN1蛋白陽性表達率高于正常胃黏膜組織，提示PIN1在胃癌的發生、進展過程中產生一定的影響。在與其臨床病理參數的比較中，筆者發現在有無淋巴結轉移分組中PIN1蛋白表達差異顯著，與相關研究結果一致；但某些方面存在不一致性，筆者考慮原因在于PIN1抗體的分類號、稀釋度、標本量、免疫組化反應結果判斷標準等存在差異。

周期蛋白(cyclin)中的CyclinD1是細胞周期中與腫瘤關系緊密的癌基因。PIN1的目標蛋白超過20種，其中最受研究者關注的是CyclinD1，CyclinD1是細胞周期中的G1期相關蛋白，其基因和編碼蛋白發生異常對腫瘤的產生和進展影響較大[10]。相關研究表明，CyclinD1是PIN1十分重要的作用目標蛋白之一，PIN1不但可促進CyclinD1轉錄，而且還可誘導CyclinD1從胞核轉移至胞質中進行降解，使得CyclinD1高表達，促使乳腺上皮細胞轉化增殖[11]。相關研究結果顯示，PIN1在正常乳腺組織中陰性表達，只在乳腺癌組織中陽性表達。在PIN1高表達的60例乳腺癌中42例合并CyclinD1高表達，而在PIN1低表達的48例乳腺癌中僅有25例CyclinD1陰性表達，同時CyclinD1表達還與淋巴結轉移存在一定的關系[12]。PIN1不管是激活Ras信號傳導途徑還是應激活化蛋白激酶(SAPK)，目標均是為了提升c-Jun的轉錄活性。另有研究發現，PIN1在人類乳腺癌組織中過表達，在正常乳腺上皮細胞和乳腺癌旁組織中呈現低表達，且其表達水平與乳腺癌臨床病理分期存在相關性。國內研究者通過蛋白質體學在胃癌差異蛋白質研究中發現PIN1高表達[11]。本研究結果顯示，胃癌組織PIN1陽性表達率明顯高于對照組，且與淋巴結轉移存在一定的關系，提示PIN1可能參與腫瘤產生、進展以及轉移過程。國外研究者發現，PIN1表達與前列腺癌術后早期復發的危險性存在顯著相關性，高表達者復發的危險性高于低表達者[10]。另有研究表明，過表達的PIN1可促進正常乳腺上皮細胞轉化，且可穩固已被neu(c-erbB-2)和Ras癌基因誘導的惡性表型，敲除PIN1則可逆轉此種惡性表型，甚至還會引發癌細胞凋亡[9]。故對PIN1表達進行測定對于腫瘤的診斷和治療、預后具有一定的預測價值，并可作為潛在的治療目標。

本研究結果顯示，FPN在胃癌組織中低表達，且與胃癌的TNM分期存在相關性，與患者的性別、年齡、淋巴結轉移均無顯著相關性。大量研究亦報道了FPN在不同類型腫瘤中的表達及其臨床意義[8-10]。國外研究結果顯示，乳腺癌患者的FPN mRNA呈低表達，且與乳腺癌的預后有明顯關系[8]。故筆者認為在胃癌組織中FPN是鐵調素的下游目標之一，鐵調素通過促進FPN低表達以及誘導FPN降解來對鐵代謝進行調節，繼而對腫瘤細胞的分裂增殖產生影響。此與相關國外研究結果一致。

綜上所述，胃癌組織中存在FPN、PIN1蛋白陽性表達，且與患者的臨床病理參數相關，今后筆者將在此基礎上進行深入研究，使FPN、PIN1有可能作為判定胃癌TNM分期和高危轉移的有效指標，并用于臨床指導胃癌的治療。