DNA甲基化激活磷酸肌醇代謝在口腔白斑癌變中的意義

王廣超，劉麗駿，蔣偉文

上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔黏膜病科，上海交通大學口腔醫學院，國家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫學重點實驗室，上海市口腔醫學研究所，上海（200011）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常見的惡性腫瘤之一，吸煙和酗酒是OS?CC的主要病因［1］。口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）是口腔黏膜上以白色斑塊或斑片為主的損害，不能定義為其它任何疾病，是最常見的口腔癌前病損。OLK惡變的最可預測因素是活檢中存在異型增生，研究表明異型增生患者的惡性風險為31.4%～36.3%［2］。因此，明確OLK和OSCC的生物學關系，對于預防OLK癌變和OSCC的早期診斷有重要意義。

除基因組突變外，表觀遺傳學改變已被確定為OSCC的重要特征［3］，尤其是轉錄起始位點啟動子附近發生的DNA甲基化，通常會造成基因表達沉默和信號通路失調［4］。而且，在許多癌癥中，通過啟動子DNA甲基化導致的抑癌基因失活甚至比體細胞突變更加頻繁［5］。DNA甲基化可能推動腫瘤發生和惡性進展。本文探討DNA甲基化修飾在口腔白斑癌變中的作用，為揭示DNA甲基化在癌前病變和腫瘤發病過程中的關鍵調控因子提供依據。

1 材料和方法

1.1 收集樣本和Illumina 450K甲基化芯片檢測

在上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科和口腔黏膜病科就診患者中收集40例OSCC組織樣本、28例OLK組織樣本和40例正常健康口腔黏膜組織樣本。其中，40位捐贈OSCC組織樣本的患者來自口腔頜面外科，口腔黏膜病史不詳。本研究已獲得上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院倫理審查委員會的批準，并獲得了患者的知情同意。使用Illumina 450K甲基化芯片（博奧生物，北京）檢測上述樣本，得到DNA甲基化位點的β值數據［6］。

1.2 GEO數據庫中表達譜數據整理

檢索GEO（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫，得到OSCC、OLK以及正常口腔黏膜組織的表達譜數據。根據實驗需求選用GSE33205［7］和GSE85195［8］兩個表達譜數據集。

1.3 DNA甲基化譜和表達譜數據特點統計分析

在R語言平臺上，分別在40例OSCC組織樣本、28例OLK組織樣本以及40例健康口腔黏膜組織樣本中隨機選取1例OSCC、1例OLK和1例健康口腔黏膜樣本，選取DNA甲基化β值最少的5%位點。計算這些位點在上述3例不同樣本之間的重疊率。重復上述過程10次，得到不同類別樣本的平均重疊率。分別在40例OSCC組織樣本、28例OLK組織樣本以及40例健康口腔黏膜組織樣本中隨機選擇2例相同類別的樣本，重復上述過程10次，得到相同類別樣本的平均重疊率。下載GSE85195數據集，分別隨機選取1例OSCC樣本，1例OLK樣本以及另外1例健康口腔黏膜樣本，得到表達值位于95%以上的探針ID。計算這些探針ID在不同樣本之間的重疊率。重復上述過程10次，得到不同類別樣本的平均重疊率。在GSE85195數據集中隨機選取2例OSCC，2例OLK，在GSE33205數據集中隨機選擇2例健康口腔黏膜樣本，得到表達值位于95%以上的探針ID，計算這些探針在相同類別樣本中的重疊率。重復上述過程10次，得到相同類別樣本的平均重疊率。

1.4 篩選OSCC和OLK差異DNA甲基化位點并整理相應的表達譜數據

在R語言平臺上，所有樣本的β值轉換為M值［9］。分別計算OSCC、OLK和健康口腔黏膜每個位點的平均M值。選取OSCCvs.Normal平均值相差大于1.4的位點，以及OLKvs.Normal平均值相差大于1.4的位點。加載Limma包，對上述位點進行差異分析［10］。選取P＜0.01且校正后P＜0.05的位點。整理后得到OSCC差異甲基化位點和OLK差異甲基化位點。下載GSE85195的數據集，提取OSCC和OLK差異甲基化位點所在基因的表達譜數據。計算OSCC和OLK每一個探針的平均表達強度，輸出整理后的表格供后續分析使用。

1.5 生物學通路分析

在IPA生物學通路（Ingenuity Pathway Analysis）平臺（QIAGEN，德國）上，提交OSCC和OLK差異甲基化位點相關基因的表達譜數據。分別進行核心分析和對比分析。得到分析報告后，分別下載經典通路的富集結果以及顯著富集的網絡。在對比分析中下載共同富集的通路。

2結果

2.1 DNA甲基化譜相對表達譜數據具有更多的差異性

本實驗共獲得48 5203個DNA甲基化位點在28例OLK，40例OSCC和40例健康口腔黏膜樣本中的β值數據（圖1）。GSE33205數據集中含有50例HNSCC和25例健康口腔黏膜樣本。GSE85195數據集中含有15例OLK和34例OSCC和1例健康口腔黏膜樣本（表1）。在各樣本兩兩比較中，DNA甲基化譜的數據在貝塔值最小的5%重疊率為61%～67%，而表達譜數據在表達量最多的5%重疊率為75%～83%（表2、表3）。

表1 本次實驗選用的外部表達譜數據集Table 1 External expression profile data set selected for this experiment

表2 DNA甲基化譜在β值最小時的5%重疊率Table 2 5%overlap of DNA methylation spectrum at the lowestβvalue

表3 表達譜在表達量最大時的5%重疊率Table 3 The 5%overlap rate of the expression profile at the maximum expression level

2.2 差異DNA甲基化位點和表達譜數據整理結果

Figure 1 Heatmap of partial detection of Illumina 450K meth?ylation chip圖1 Illumina 450K甲基化芯片部分檢測熱圖

本實驗在28例OLK和40例健康口腔黏膜DNA甲基化芯片數據比對中得到4 396個OLK差異DNA甲基化位點。在40例OSCC和40例健康口腔黏膜DNA甲基化芯片數據比對中得到3 475個OSCC差異DNA甲基化位點。其中，OLK差異DNA甲基化位點中有671個DNA甲基化位點在OLK組織中上調，有3 725個DNA甲基化位點在OLK組織中下調。另外，在OSCC差異DNA甲基化位點中有2 768個DNA甲基化位點在OSCC組織中上調，有707個DNA甲基化位點在OSCC組織中下調。OLK和OSCC差異DNA甲基化位點相交423個。4 396個OLK差異DNA甲基化位點經注釋得到1 809個對應基因。3 475個OSCC差異DAN甲基化位點經注釋得到1 457個對應基因。其中，這兩者相交338個基因。提取GSE85195數據集的表達譜數據，1 809個OLK差異DNA甲基化位點相關基因位于表達譜芯片中的2 862個探針上，其中1 805個探針在OLK表達譜數據中顯示上調，1 057個探針在OLK表達譜數據中顯示下調。1 457個OSCC差異DNA甲基化位點相關基因位于表達譜芯片中的2 198個探針上，其中1 117個探針在OSCC表達譜數據中顯示上調，1 081個探針在OSCC表達譜數據中顯示下調。

2.3 OLK差異DNA甲基化相關基因主要參與細胞運動和分化

OLK差異DNA甲基化相關基因的IPA生物學通路和網絡分析表明，在OLK組織中，細胞骨架的組織、多種發育過程、結締組織分化和細胞運動等過程處于活躍狀態。其中Sp3轉錄因子（Sp3 tran?scription factor，SP3）、Sp4轉錄因子（Sp4 transcrip?tion factor，SP4）、淋巴增強因子1（lymphoid enhanc?er binding factor 1，LEF1）、KLF4（Kruppel like factor 4）、早期B淋巴細胞因子（early B?cell factor 2，EBF2）、GATA結合蛋白4（GATA binding protein 4，GATA4）、GLI1（GLIfamily zinc finger 1，GLI1）活化，激活RNA轉錄和表達。細胞粘附分子SDCBP（syn?decan binding protein，SDCBP）、CTNNB1（catenin be?ta 1，CTNNB1）活化促進細胞運動和分化。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、神經生長因子（nerve growth factor，NGF）、成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）和胰島素樣生長因子1受體（insulin?like growth factor 1 recep?tor，IGF1R）以及絲裂原活化激酶?7（mitogen?activat?ed protein kinase，MAPK7）活化增強細胞存活抗凋亡。同時，染色質修飾蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶5B（lysine demethylase 5B，KDM5B）抑制，賴氨酸乙 酰 轉 移 酶6A（lysine acetyltransferase 6A，KAT6A）、SWI/SNF相關，基質關聯，肌動蛋白依賴染色質調控因子，亞家族a，成員4（SWI/SNF relat?ed，matrix associated，actin dependent regulator of chromatin，subfamily a，member 4，SMARCA4）活化使得組蛋白和染色質結構得到相應修飾。含鈣離子依賴性C2結構域的蛋白質5（C2 calcium depen?dent domain containing 5，C2CD5）活化促進葡萄糖轉運（圖2）。

2.4 OSCC差異DNA甲基化相關基因參與細胞癌變的多個過程

在IPA生物學通路分析平臺上，得到OSCC差異甲基化相關基因相互作用網絡富集結果，富集評分大于或等于40的網絡共有3個。網絡1相關基因主要富集在細胞運動，遷移，分化等生物學過程和通路。網絡2相關基因主要富集在發育，氧化調節、蛋白折疊、抗凋亡等生物學過程和通路。網絡3相關基因主要富集在離子轉運，細胞遷移，細胞周期等生物學過程和通路。為了方便展示，把這三個網絡合并為一個網絡（圖3）。其中，視黃醇脫氫酶（dehydrogenase/reductase 3，DHRS3）、谷胱甘肽過氧化物酶3（glutathione peroxi?dase 3，GPX3）、細胞色素P450家族成員CYP26A1（cytochrome P450 family 26 subfamily A member 1，CYP26A1）以及多種氧化損傷保護蛋白下調，從而增加細胞氧化損傷，進一步加重蛋白折疊錯誤率。在血管內皮細胞生長因子（vascular endotheli?al growth factor，VEGF）的作用下，多種同型盒基因表達改變促進細胞增殖和分化。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）信號通路活化促使肌鈣蛋白和錨定蛋白激活，進而重組細胞骨架。髓系細胞觸發受體2（triggering re?ceptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）活化觸發組成型炎性細胞因子的產生形成慢性炎癥，伽馬分泌酶（Secretaseγ）增多使線粒體功能失調，鉀通道四聚化結構域?2（potassium channel tetramer?ization domain containing 2，KCTD2）、氯離子通道Tweety家族蛋白成員TTYH1（Tweety family mem?ber 1）、鈣離子通道蘭尼定受體1（ryanodine recep?tor 1，RYR1）以及鈉離子和碳酸根離子轉運蛋白SLC4A7（solute carrier family 4 member 7）的表達也受到影響，這些改變共同促進細胞增殖，遷移和染色質重塑。

2.5 OSCC和OLK差異DNA甲基化位點相關基因共同富集在磷酸肌醇代謝過程

在IPA生物學通路分析平臺上，對比分析結果表明，OSCC和OLK差異甲基化位點相關基因在多種磷酸肌醇生物合成和代謝以及磷脂酶C信號通路富集（表4）。其中肌醇磷酸生物合成，3?磷酸肌醇生物合成，肌醇四磷酸磷酸酯生物合成以及5?磷酸肌醇代謝在OLK和OSCC中均處于活化狀態。磷脂酶C信號通路在OSCC中抑制，在OLK中活化。

Figure 2 The genes associated with OLK differential DNA methylation sites are mainly involved in cell movement and differentiation圖2 口腔白斑差異DNA甲基化位點相關基因主要參與細胞運動和分化

Figure 3 OSCC differential DNA meth?ylation related gene enrichment network圖3 口腔鱗狀細胞癌差異DNA甲基化相關基因富集網絡

表4 口腔鱗狀細胞癌與口腔白斑差異DNA甲基化位點相關基因顯著富集的前6個通路Table 4 The first six pathways with significant enrichment of genes related to different methylation sites of OSCCand OLK

3討論

為了驗證在腫瘤形成過程中DNA甲基化是否具有不同程度的改變，本實驗選用DNA甲基化程度最低的位點進行重復比對分析。低表達的mRNA在實驗過程中不穩定，并且在檢測過程中容易受系統誤差干擾，因此表達譜對比部分，本實驗選用表達量最高的5%進行分析。研究表明，DNA甲基化修飾具有靈活變化的特點，表達譜相對穩定。由于基因表達受到多種表觀因素的影響，表觀遺傳的可塑性使得細胞可以通過啟動新的轉錄程序增加調節潛力，從而改變細胞的可延展方式［11］。這意味著表觀系統具有更早的接受外部信息的能力，可以被應用于腫瘤形成的早期診斷。

腫瘤發生和進展是涉及多層次、多過程、多通路的復雜過程。研究表明，腫瘤的發生伴隨著多個基因突變以及染色體結構異常，從而促使細胞進入惡性增殖過程［12］。DNA甲基化是重要的染色質修飾手段。DNA通過甲基化修飾，可以沉默或激活相關基因，改變染色體折疊狀態，進而促進機體發育和細胞分化［13］。目前已有大量研究表明，DNA甲基化修飾的改變在OSCC發病過程中有重要作用，尤其是抑癌基因啟動子區域高甲基化失活可能成為細胞癌變的關鍵步驟［3，14］。本研究差異DNA甲基化結果證實，不僅僅在腫瘤發生階段，甚至在癌前病變中，就已經存在較多DNA甲基化的改變。研究表明，在癌前狀態下，由于外部不良刺激以及局部炎癥壓力，促使細胞骨架重組和上皮間充質轉變［15］。在這個過程中染色質也會有相應的重塑，而DNA甲基化修飾是重要的調節方式［16］。

在腫瘤發生早期，由于內外壓力共同作用，細胞會有一定時間的呼吸爆發，產生過量的反應性活性氧。這些活性氧產物會通過各種途徑導致線粒體呼吸鏈損傷以及DNA突變。維持DNA的高保真性是一個高耗能的過程。為了維持DNA穩定，在線粒體功能不足的情況下，那些選擇無氧糖酵解的細胞有更大的可能性從凋亡的命運中逃離出來。在OSCC生物學通路分析中，伴隨DNA甲基化改變，多個抗氧化保護蛋白下調。它們有的定位于線粒體，有的定位于細胞質。本課題組以往的研究發現，HNSCC中的泛醌還原酶亞基A13處于高甲基化低表達狀態［17］。與此類似，本研究OSCC表達譜結果證實泛醌還原酶亞基A1在OSCC中同樣處于低表達狀態。有趣的是，泛醌還原酶亞基A1在OLK中處于低甲基化高表達狀態。泛醌還原酶位于線粒體內膜，是有氧氧化呼吸鏈的重要蛋白。以上研究結果反映OSCC發生過程中可能存在有氧呼吸增強而后弱化的過程，這為抗氧化藥物預防OLK癌變提供了依據。

多個離子通道和轉運分子活化結果表明OSCC進展過程中伴隨頻繁的離子內外交換，可能參與多個癌變過程。同以往研究結果一致，在OSCC和OLK組織中，鈣通道蛋白蘭尼定受體2（ryanodine receptor 2，RYR2）處于高甲基化低表達狀態［18］。另外，本實驗發現OSCC和OLK組織中的RYR1處于低甲基化高表達狀態。鈣離子信號在分化和組織動態平衡中具有重要作用。由于體細胞突變或表觀遺傳沉默引起的鈣離子信號變化改變會削弱分化，與其它致癌因素相結合，可能加速促進口腔黏膜細胞癌變的進程。

炎細胞浸潤和免疫反應是細胞癌變的常見現象。持續的炎性環境產生了大量的活性氧簇，促使炎細胞釋放細胞因子、趨化因子、生長因子等炎性介質，其引發的級聯反應能夠誘導細胞增殖。

中性粒細胞和巨噬細胞活化后將產生大量反應性活性氧和反應性活性氮等氧化物。它們可促進增殖細胞發生DNA損傷、癌基因激活及抑癌基因失活。反復的慢性炎癥刺激還將通過各種信號通路募集免疫抑制性細胞，這些細胞激活后能抑制T細胞和自然殺傷細胞的功能，促進突變細胞免疫逃逸。在炎癥反應中，磷酸肌醇代謝參與多種炎癥信號轉導［19］。本研究證實，從癌前狀態的OLK到腫瘤形成的OSCC均伴隨磷酸肌醇代謝活動的增強，這提示了DNA甲基化狀態改變導致磷酸肌醇代謝活動增強可能是OSCC發生發展的重要誘因；磷酸肌醇代謝以及磷脂酶C相關基因表達和DNA甲基化檢測可能成為OSCC風險評估的重要因素。

【Author contributions】Wang GC collected，processed and ana?lyzed the data and wrote the article.Liu LJ processed the research.Ji?ang WW designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.