止血祛瘀明目片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

姬于婷，賈麗華，張國(guó)躍

（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065）

止血祛瘀明目片是由丹參、地黃、三七、大黃、黃芩、女貞子等藥味經(jīng)加工制成的片劑，具有化瘀止血、滋陰清肝、明目的功效，主要用于陰虛肝旺、熱傷絡(luò)脈所致的眼底出血等癥。本研究中對(duì)止血祛瘀明目片的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)WS－10258（ZD－0258）－2002－2012Z中 的 鑒別、含量測(cè)定等項(xiàng)目進(jìn)行驗(yàn)證，并建立了鑒別女貞子中特女貞苷的薄層色譜（TLC）法、測(cè)定丹參中丹酚酸B含量的高效液相色譜（HPLC）法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LG－20AD型高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司）；Waters e2695／2487型高效液相色譜儀（配有2487型紫外檢測(cè)器和Empower工作站，美國(guó)Waters公司）；SartoriusAGME235S型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度為十萬(wàn)分之一）；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；BX41型顯微鏡與CCD成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；自制薄層板薄層色譜硅膠G（青島海海洋化工有限公司）；薄層硅膠G預(yù)制板（德國(guó)Merck公司，批號(hào)為HX124891；青島海洋化工廠分廠，批號(hào)為20120320）。

1.2 試藥

止血祛瘀明目片（批號(hào)分別為131201，131202，130903），不含女貞子、丹參的陰性樣品，均由廠家制備并提供。特女貞苷對(duì)照品（批號(hào)為111926－201203，含量為100%），丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)為111562－200908，含量為100%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；試驗(yàn)用水分別采用純化水和超純水；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參和三七的顯微鑒別

本研究中采用顯微鑒別丹參和三七，結(jié)果可見相應(yīng)的特征組織和細(xì)胞。詳見圖1。

圖1 顯微鑒別特征圖（10×40）Fig.1 Microscopic identification characteristics（10×40）

2.2 女貞子的TLC鑒別

取樣品20片，剝?nèi)グ拢心コ杉?xì)粉，加入甲醇30mL，超聲處理30 min（功率為500 W，頻率為40 kHz），濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，加入中性氧化鋁3 g，拌勻，置水浴上蒸干，研細(xì)，加在中性氧化鋁柱（100～200目，規(guī)格為2 g，內(nèi)徑為1～1.5 cm）上，用甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液，作為供試品溶液。取不含女貞子的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照藥材溶液。另取特女貞苷對(duì)照品適量，精密稱定，并加甲醇適量，制成每1 mL含2 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。照TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇－水（20∶2∶1，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置處顯相同顏色的熒光淬滅斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾，斑點(diǎn)分離度符合要求，方法可行。詳見圖2。

圖2 女貞子的薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatograms of Fructus Ligustri lucidi

2.3 HPLC法測(cè)定丹酚酸B的含量

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Ultimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－乙腈－甲酸－水（27∶9∶1∶63，V／V／V／V）；流速：1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)應(yīng)不低于4000。

2.3.2 溶液制備

取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，用75%甲醇制成每1 mL含50μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取樣品20片，剝?nèi)グ卵心コ杉?xì)粉，再取0.2 g，精密稱定，放入錐形玻璃瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，水浴加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取不含丹酚酸B的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3.3 測(cè)定波長(zhǎng)確定

取丹酚酸B對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為10μg／mL），在200～400 nm波長(zhǎng)范圍掃描紫外光譜圖，結(jié)果在285.6 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》丹參［1］項(xiàng)下內(nèi)容，確定測(cè)定波長(zhǎng)為286 nm。

2.3.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取不含丹參的陰性樣品，依法制備丹參陰性對(duì)照品溶液，取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專屬性強(qiáng)。詳見圖3。

圖3 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖圖3 HPLC chromatograms of the specificity test

線性關(guān)系考察：分別精密吸取丹酚酸B對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為64.172 5μg／mL）1，2，5，10，15，20μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝69 650X－644.9，r＝0.999 5（n＝6）。結(jié)果表明，丹酚酸B進(jìn)樣量在0.064 17～1.283 45μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為64.172 5μg／mL），重復(fù)進(jìn)樣、測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD為0.16%（n＝7），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為130903）樣品6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果樣品中丹酚酸B平均含量為10.620 6 mg／g，RSD為0.64%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為130903）樣品按重復(fù)性試驗(yàn)方法測(cè)定含量。結(jié)果丹酚酸B含量的RSD%為1.69%（n＝6），結(jié)果較滿意。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為130903）樣品0.2062g，依法制備供試品溶液，分別于0，2，3，5，9，12，21 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD為1.23%（n＝7），表明供試品溶液在21 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為130903）樣品0.1g，精密稱定，共6份，加入質(zhì)量濃度為0.942 8 mg／mL的丹酚酸B對(duì)照品溶液1 mL，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 丹酚酸B加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test of salvianolic acid B（n＝6）

2.3.5 PDA光譜掃描與峰純度檢測(cè)

取供試品溶液與丹酚酸B對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，使用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行PDA光譜掃描，選定200～400 nm波長(zhǎng)范圍的PDA光譜進(jìn)行比較。結(jié)果供試品溶液色譜圖中呈現(xiàn)與丹酚酸B對(duì)照品溶液色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰，且色譜峰的特征相同；同時(shí)采用Waters Empower工作站處理數(shù)據(jù)，結(jié)果樣品的峰純度符合要求。

2.3.6 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定丹酚酸B的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Content determination of salvianolic acid B in the samples（n＝3）

3 討論

女貞子TLC鑒別中，曾將樣品經(jīng)超聲處理30 min后濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，直接點(diǎn)樣，干擾的斑點(diǎn)較多，故增加用中性氧化鋁柱除雜的步驟。翟少欽等［2］采用乙酸乙酯－丙酮－甲酸－水系統(tǒng)作為展開劑，用1%香草醛硫酸乙醇溶液顯色，發(fā)現(xiàn)樣品有斑點(diǎn)擴(kuò)散現(xiàn)象，并有其他斑點(diǎn)干擾，改用擬訂方法后效果較滿意。丹酚酸B的含量測(cè)定比較了乙醇和甲醇作為提取溶劑制備供試品溶液，結(jié)果用乙醇提取后的溶液，丹酚酸B含量低于甲醇；又比較了不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇，發(fā)現(xiàn)用低體積分?jǐn)?shù)的甲醇作為溶劑，丹酚酸B含量雖稍高一些，但雜峰較多，尤其是在目標(biāo)峰附近有干擾峰，故選擇75%甲醇作為提取溶劑；考察用不同的提取時(shí)間處理樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理時(shí)間超過(guò)1 h，丹酚酸B的含量并未明顯升高。

女貞子的現(xiàn)代藥理學(xué)研究［3－7］顯示，其含有多種具有生理活性的有機(jī)酸，如齊墩果酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸，還含有D－甘露醇、黃酮類、氨基酸、糖類等化合物。女貞子提取物中的還原性鐵離子能清除自由基及抑制α－葡萄糖苷酶，具有抗氧化、降糖、調(diào)脂作用。女貞子素有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效，采用TLC法對(duì)女貞子進(jìn)行定性鑒別具有實(shí)際意義。

丹參活血化瘀，藥理作用廣泛［8－9］，其化學(xué)成分可分為兩類：脂溶性成分主要是以丹參酮型二萜為主的二萜類，如丹參酮ⅡA等；水溶性成分主要是以酚酸為主，如丹酚酸B。此外，丹參還含有黃酮、甾體、三萜等成分。本研究中測(cè)定的丹酚酸B是丹參藥材中生物活性很強(qiáng)且含量最高的水溶性化合物，可以抗血小板黏附和聚集，具有抗氧化、清除氧自由基、保護(hù)缺血性神經(jīng)損傷和抗炎等重要作用。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只收載了丹參酮ⅡA的含量測(cè)定方法，未控制酚酸類水溶性成分。本研究中旨在用丹參酮ⅡA和丹酚酸B雙指標(biāo)來(lái)全面反映丹參的含量。韓治華等［10］研究發(fā)現(xiàn)，止血祛瘀明目片組方合理，多種藥味聯(lián)合作用，對(duì)非缺血型視網(wǎng)膜靜脈阻塞的療效顯著，可擴(kuò)張微血管，改善微循環(huán)，幫助建立側(cè)支循環(huán)，增加血液灌流量，有助于恢復(fù)視力。應(yīng)用止血祛瘀明目片治療非缺血型視網(wǎng)膜靜脈阻塞的臨床效果顯著［11－12］。

綜上所述，該方法簡(jiǎn)便可靠，準(zhǔn)確度高，所擬訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本可行，可有效控制止血祛瘀明目片的質(zhì)量。