西格列汀對人胰淀素轉(zhuǎn)基因小鼠血糖的干預(yù)研究

張強，張曾，楊宏杰，何燕銘

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200437

胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能持續(xù)衰竭是2型糖尿病(T2DΜ)主要的病理缺陷。其中β細(xì)胞凋亡是胰島功能衰竭的主要因素[1]，因此抑制β細(xì)胞凋亡是改善胰島功能的關(guān)鍵。西格列汀是目前用于治療2型糖尿病最常用DPP-4酶抑制劑，目前研究表明其可延緩及抑制β細(xì)胞凋亡的作用[2-5]。胰淀素(islet amyloid-like polypeptide，IAPP)又名胰島淀粉樣多肽，是一種由37個氨基酸殘基組成的多肽，儲存在胰島β細(xì)胞的分泌顆粒中，與胰島素同時分泌。哺乳類、人、靈長類和貓的胰淀素會形成胰島淀粉樣蛋白變性纖維，嚙齒類的胰淀素則不能。在高糖刺激、氧化應(yīng)激等病理狀態(tài)下，人IAPP(human IAPP，hIAPP)可自我折疊、變性、聚集，其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)由α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B形成寡聚體[6]，hIAPP寡聚體可進(jìn)一步誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的凋亡，促使胰島功能衰竭和血糖異常[7-8]。本研究旨在探討西格列汀對人胰淀素轉(zhuǎn)基因小鼠(hIAPP-Tg)糖尿病模型是否有改善血糖作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料 兩對hIAPP-Tg小鼠購自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ΜE，USA)；8只SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，質(zhì)量(20±2)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司；西格列汀(100 mg/片)購自美國默沙東公司；胰島素及糖化血紅蛋白ELISA試劑盒(X-Y Biotechnology，上海，中國)；小鼠胰島素抗體(Abcam，Cambridge，UK)、CHOP抗體(CST，Boston，USA)；便攜式血糖儀及試紙(拜安捷，拜爾，德國)。

1.2 動物分組及給藥 hIAPP-Tg小鼠交于上海南方模式科技有限公司代為繁殖鑒定，與C57BL/6小鼠雜交、通過剪尾、RT-PCR及real-time PCR法獲得F3代18只hIAPP高表達(dá)陽性小鼠(雄性、8周齡)，隨機分為模型組和西格列汀組(20 mg/kg)各9只；對照組8只C57BL/6小鼠(雄性、8周齡)；對照組及模型組給予磷酸鹽緩沖液(PBS)，西格列汀組給予西格列汀20 mg/kg。根據(jù)體質(zhì)量(1 mL/100 g)給予灌胃，隔天一次，連續(xù)給藥10周，每兩周用便攜式血糖儀測鼠尾末梢空腹血糖一次并測量體質(zhì)量。

1.3 生化及組織病理實驗 給藥結(jié)束后所有動物禁食過夜，并在戊巴比妥麻醉下(腹腔注射100 mg/kg)，然后處死。處死后取血清、用ELISA法檢測胰島素及糖化血紅蛋白水平；同時取胰腺組織、稱重并立即在液氮中冷凍。取少許組織固定在4%(wt/vol)磷酸鹽緩沖的多聚甲醛中并用石蠟包埋，免疫熒光法檢測胰島素及C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達(dá)。

1.4 觀察指標(biāo) 每兩周測定各組小鼠空腹血糖及體質(zhì)量；試驗結(jié)束后檢測各組胰島素及糖化血紅蛋白水平，免疫熒光檢測胰腺胰島素及CHOP表達(dá)變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0進(jìn)行分析，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西格列汀對hIAPP-Tg小鼠空腹血糖及體質(zhì)量的影響 與對照組比較，模型組及西格列汀組空腹血糖在8周齡時開始明顯升高并隨飼養(yǎng)時間逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，西格列汀治療后空腹血糖呈下降趨勢，在給藥第10周后空腹血糖較模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1；模型組及西格列汀組體質(zhì)量較對照組低，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表1 各組小鼠間空腹血糖比較(±s，mmol/L)

表1 各組小鼠間空腹血糖比較(±s，mmol/L)

注：與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

組別對照組模型組西格列汀組F值P值例數(shù)899 0周5.65±0.41 8.18±2.62a 8.09±1.94 4.559 0.021 2周7.63±1.06 11.70±3.60a 11.32±5.00 3.111 0.064 4周5.23±0.27 8.89±3.04a 8.41±4.27 3.449 0.049 6周5.85±0.71 11.16±5.87a 10.18±3.14 4.268 0.027 8周5.68±0.80 11.06±5.00a 10.37±4.65 4.342 0.025 10周5.5±0.31 13.34±4.19a 9.50±3.21b 13.44 0.000

表2 各組小鼠間體質(zhì)量比較(±s)

表2 各組小鼠間體質(zhì)量比較(±s)

注：與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

組別對照組模型組西格列汀組F值P值例數(shù)899 0周24.01±0.74 24.48±1.14a 23.52±1.35 1.638 0.216 2周25.89±1.27 25.69±2.00a 24.39±2.09 1.703 0.204 4周26.58±0.88 25.88±2.74a 24.32±2.69 2.138 0.141 6周27.39±1.08 25.76±3.55a 25.06±3.40 1.366 0.275 8周28.16±1.18 25.56±3.93a 25.48±4.04 1.693 0.206 10周28.64±1.35 25.74±4.17a 25.97±4.46 1.593 0.225

2.2 西格列汀對hIAPP-Tg小鼠空腹胰島素及糖化血紅蛋白的影響 與對照組比較，模型組及西格列汀組血清胰島素水平降低、西格列汀給藥10周后血清胰島素水平較模型組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與對照組比較，模型組及西格列汀組糖化血紅蛋白升高、西格列汀給藥10周后糖化血紅蛋白較模型組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

組別對照組模型組西格列汀組F值P值例數(shù)899空腹胰島素(mIU/L)9.41±1.06 3.57±0.95a 6.61±1.74b 42.683＜0.01糖化血紅蛋白(nmol/L)1 104.67±281.96 2 512.68±396.17a 1 525.73±398.01b 33.787＜0.01

2.3 西格列汀對hIAPP-Tg小鼠胰腺胰島素及CHOP表達(dá)影響 與對照組比較，模型組胰腺胰島素表達(dá)明顯下降，經(jīng)西格列汀治療10周后西格列汀組胰島素水平較模型組有所升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與對照組比較，模型組胰腺CHOP表達(dá)明顯升高，與模型組比較經(jīng)西格列汀治療10周后CHOP明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表4和圖1。

表4 西格列汀對hIAPP-Tg小鼠胰腺胰島素及CHOP表達(dá)的影響(±s)

表4 西格列汀對hIAPP-Tg小鼠胰腺胰島素及CHOP表達(dá)的影響(±s)

注：與對照組比較，a P＜0.01；與模型組比較，b P＜0.05；與模型組比較，c P＜0.01。

組別對照組模型組西格列汀組F值P值例數(shù)899胰島素積分光密度(sum)3 595.55±1 831.12 98.22±21.34a 411.27±163.32c 13.295 0.002 CHOP積分光密度(sum)3 115.42±1 314.956 1 3719.46±4 613.05a 5 612.83±1 820.92b 14.009 0.002

圖1 hIAPP-Tg小鼠胰腺胰島素及CHOP免疫熒光結(jié)果，西格列汀可提高胰島素表達(dá)及抑制CHOP表達(dá)

3 討論

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，大多數(shù)患者在第一次接受治療前就已經(jīng)出現(xiàn)胰島β細(xì)胞分泌功能缺損情況，并隨著時間的推移患者胰島β細(xì)胞分泌功能進(jìn)行性下降，因此選擇既能降糖且能有效抑制胰島β細(xì)胞功能衰退的藥物成為研究重點。西格列汀為DPP-4酶抑制劑，可抑制DPP-4活性、提升GLP-1水平、增加葡萄糖攝取、降低肝糖原的輸出與生成，可有效降低患者血糖水平，已得到臨床廣泛應(yīng)用[9]。hIAPP-Tg小鼠模型為常用的糖尿病動物模型，既往研究表明雄性純合子小鼠在8周齡時可自發(fā)出現(xiàn)糖尿病表型，雜合子及雌性表型不穩(wěn)定[10]。

本研究結(jié)果顯示，在8周齡時模型組及西格列汀組的空腹血糖較對照組明顯升高，說明hIAPP高表達(dá)雄性小鼠8周齡時可自發(fā)為糖尿病小鼠模型，與文獻(xiàn)研究一致[10]。經(jīng)西格列汀治療10周后，hIAPP-Tg小鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白得到明顯改善，說明西格列汀對人胰淀素致糖尿病模型有降低血糖作用；其次、模型組及西格列汀組空腹胰島素水平及胰腺胰島素表達(dá)明顯減少，說明人胰淀素可導(dǎo)致小鼠胰島功能的下降，經(jīng)西格列汀治療10周后hIAPP-Tg小鼠胰島功能得到一定改善。

適當(dāng)?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)可恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的穩(wěn)態(tài)環(huán)境，維持細(xì)胞存活，是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機制，但強烈持久的應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡通路的激活[11]。胰島β細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的ERS就是β細(xì)胞凋亡的主要途徑之一[12]。胰島淀粉樣蛋白沉積是2型糖尿病的重要特征之一。研究表明，胰淀素作為胰島淀粉樣蛋白沉積的主要成分可通過多種機制引起β細(xì)胞凋亡[13]，其中ERS在胰淀素導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡中起重要作用[14]。在病理狀態(tài)下，IAPP毒性寡聚體的異常聚集，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1α、PERK及ATF6，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并進(jìn)一步通過CHOP及C-Jun氨基末端激酶(JNK)途徑誘導(dǎo)β細(xì)胞的凋亡，加速胰島功能的衰竭[15-16]。

CHOP廣泛表達(dá)于哺乳動物機體細(xì)胞，其編碼的蛋白與多種細(xì)胞功能活動(如增殖、分化、凋亡等)相關(guān)[17]。CHOP由ERS誘導(dǎo)并在生長停止和細(xì)胞死亡中起作用，CHOP表達(dá)升高是ERS的標(biāo)志，它在ERS和細(xì)胞凋亡的聯(lián)系中起到重要作用，是一個舉足輕重的中間信號分子，可通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較、模型組及西格列汀組CHOP表達(dá)明顯升高，說明人胰淀素在胰腺異常聚集可誘導(dǎo)ERS繼而激活CHOP的表達(dá)，經(jīng)西格列汀治療10周后CHOP表達(dá)有所下降，說明西格列汀可減少人胰淀素過表達(dá)引起的ERS。

綜上所述，西格列汀是目前臨床上常用的降糖藥物，在hIAPP-Tg糖尿病小鼠模型中同樣有降糖及保護(hù)胰島功能的作用，其可能的機制是西格列汀可通過抑制人胰淀素異常聚集誘導(dǎo)的ERS減少β細(xì)胞凋亡，具體機制有待進(jìn)一步研究。