透骨消痛膠囊調(diào)節(jié)Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路抑制骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究

林木南，邵 翔，許麗梅，張 欣，朱在師，韓一旦，段辛威，陳建梅，高 松，李西海*

1中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院，福建 福州350025；

2福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見(jiàn)的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，是生物力學(xué)、生物學(xué)、基因遺傳等多種復(fù)雜因素共同作用的結(jié)果，其臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙，甚至關(guān)節(jié)畸形等，主要病理變化為軟骨退變、骨贅形成、軟骨下骨重塑異常等［1-2］。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致軟骨退變的關(guān)鍵因素［3］，而Ras-Raf-絲裂原激活蛋白激酶的激酶（mitogenactivated proteinkinase kinase，MEK）-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)通路在軟骨基質(zhì)降解的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用［4-5］，也是防治OA的潛在有效靶點(diǎn)。微小核糖核酸（micro ribonucleic acids，miRNAs）是一類非編碼的小RNA分子，通過(guò)與信使RNA的直接結(jié)合，從而起到調(diào)控基因表達(dá)的作用，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控［6］。其中，miR-27b、miR-34a、miR-146a與OA發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-27b可以靶向基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-13，影響軟骨基質(zhì)的降解［7］，miR-34a則與炎癥因子介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)［8］，miR-146a可作為炎癥信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)器，參與OA炎癥反應(yīng)中［9］，均已成為OA的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

透骨消痛膠囊是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：閩制字Z20100006），具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、止痹痛之功，長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，療效可靠。本課題組前期研究顯示，透骨消痛膠囊能夠抑制OA的炎癥反應(yīng)，但具體作用機(jī)制有待深入研究［10］。因此，本研究以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)為OA細(xì)胞模型，采用透骨消痛膠囊干預(yù)，觀察Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路中關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)及miR-27b、miR-34a、miR-146a的變化，旨在揭示透骨消痛膠囊抑制OA炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，為臨床的應(yīng)用推廣提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠20只，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司［生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（滬）2017-0005］，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供飼養(yǎng)環(huán)境及設(shè)施［許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007］。本研究中處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方法符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

透骨消痛膠囊組方：巴戟天12 g，白芍12 g，川芎6 g，腫節(jié)風(fēng)6 g。參照前期透骨消痛膠囊提取方法［11］：14倍量超純水回流提取藥物2次，每次微沸后計(jì)時(shí)2 h，合并濾液后過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，完全干燥后稱取浸膏使用無(wú)菌PBS配制藥物母液100 mg／mL，超聲溶解后，無(wú)菌濾頭過(guò)濾，4℃保存，備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。

LPS（美國(guó)Sigma公司）；顯影液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；MMP-3、MMP-13、p-ERK1／2、ERK1／2、MEK1／2、Raf、Ras抗體（美國(guó)Abcam公司）；羊抗兔、羊抗小鼠（武漢博士德生物公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 軟骨細(xì)胞提取與鑒定

采用機(jī)械-Ⅱ型膠原酶消化法獲得大鼠原代軟骨細(xì)胞，即麻醉處死大鼠后，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，手術(shù)刀片削取透明軟骨層，Ⅱ型膠原酶消化處理，每隔2 h收集消化液，離心后即獲得原代軟骨細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶85%時(shí)，進(jìn)行傳代。取第2代軟骨細(xì)胞，爬片培養(yǎng)后，多聚甲醛固定、0.5%Txiton處理，根據(jù)免疫組化試劑盒（武漢博士德公司）試劑說(shuō)明進(jìn)行操作，DAB顯色液（北京中杉公司）顯色，顯微鏡觀察下記錄結(jié)果。

2.2 軟骨細(xì)胞分組和干預(yù)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的第2代軟骨細(xì)胞分為4組，參照本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果［11-12］，10 ng／mL LPS誘導(dǎo)建立軟骨細(xì)胞炎癥模型，透骨消痛膠囊最佳干預(yù)濃度為300μg／mL。具體干預(yù)方法如下：空白組用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)8 h；模型組用含10 ng／mL LPS的10%FBS DMEM培養(yǎng)8 h；抑制劑組先用含10 ng／mL U0126的10%FBS DMEM干預(yù)30 min，再加入LPS培養(yǎng)8 h；透骨消痛膠囊組用含10 ng／mL LPS及300μg／mL透骨消痛膠囊的10%FBS DMEM同時(shí)培養(yǎng)8 h。

2.3 蛋白表達(dá)檢測(cè)

各組干預(yù)結(jié)束后，收集蛋白樣本，依據(jù)碧云天BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行定量，獲取蛋白濃度，變性后，采用蛋白免疫印跡（Western blot）法對(duì)蛋白進(jìn)行處理，顯影曝光后獲得條帶，并選擇β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行計(jì)算分析。每個(gè)指標(biāo)獲得3次有效數(shù)據(jù)后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4 基因表達(dá)檢測(cè)

各組干預(yù)結(jié)束后，采用Trizol法提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度。再依據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，根據(jù)ChamQ?SYBR?qPCR Master Mix說(shuō)明，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，選擇GAPDH作為參照指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算，其中引物序列見(jiàn)表1。

2.5 miRNAs表達(dá)檢測(cè)

各組干預(yù)結(jié)束后，美國(guó)Taqman公司mirco-RNA提取試劑盒提取總miRNA，檢測(cè)miRNA濃度后，依據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物，qPCR法進(jìn)行檢測(cè)，分析計(jì)算所得數(shù)據(jù)。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of qPCR

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細(xì)胞鑒定結(jié)果

Ⅱ型膠原組化陽(yáng)性組細(xì)胞胞漿被染為棕黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，陰性對(duì)照組細(xì)胞胞漿未見(jiàn)明顯棕黃色染色，僅有細(xì)胞核被染為藍(lán)色，表明所獲得的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

3.2 軟骨細(xì)胞蛋白檢測(cè)結(jié)果

圖1 免疫組化鑒定（×400）Figure 1 Identification by using immunocytochemistry（×400）

軟骨細(xì)胞中Ras、Raf、MEK1／2、MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)比較，模型組比空白組明顯升高（P＜0.01，P＜0.05），p-ERK1／2模型組比空白組表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，抑制劑組與透骨消痛膠囊組Ras、Raf、p-ERK1／2、MEK1／2、MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.01，P＜0.05），其中MEK1／2蛋白表達(dá)透骨消痛膠囊組比模型組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2和表2。

圖2 Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控因子及MMPs蛋白表達(dá)比較Figure 2 Comparison of key factors of Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2 signaling pathway and expression of MMPs protein

表2 Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控因子及MMPs蛋白表達(dá)比較（±s）Table 2 Comparison of key factors of Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2 signaling pathway and expression of MMPs protein（±s）

表2 Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控因子及MMPs蛋白表達(dá)比較（±s）Table 2 Comparison of key factors of Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2 signaling pathway and expression of MMPs protein（±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。Note:Compared with the model group,1)P＜0.01,2)P＜0.05.

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3.3 軟骨細(xì)胞基因檢測(cè)結(jié)果

軟骨細(xì)胞中MEK1／2、ERK1／2、MMP-3、MMP-13基因表達(dá)比較，模型組比空白組均明顯升高（P＜0.01）；抑制劑組、透骨消痛膠囊組比模型組表達(dá)均降低（P＜0.01，P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 MEK1／2、ERK1／2、MMP-3和MMP-13 mRNA表達(dá)比較（2-△△CT）（±s）Table 3 Comparison of MEK1／2，ERK1／2，MMP-3 and MMP-13 mRNA expression（2-△△CT）（±s）

表3 MEK1／2、ERK1／2、MMP-3和MMP-13 mRNA表達(dá)比較（2-△△CT）（±s）Table 3 Comparison of MEK1／2，ERK1／2，MMP-3 and MMP-13 mRNA expression（2-△△CT）（±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。Note:Compared with the model group,1)P＜0.01,2)P＜0.05.

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3.4 軟骨細(xì)胞mi RNAs檢測(cè)結(jié)果

軟骨細(xì)胞中miR-27b的表達(dá)，模型組低于空白組（P＜0.01），抑制劑組、透骨消痛膠囊組均高于模型組（P＜0.01）；miR-34a、miR-146a的表達(dá)，模型組均高于空白組（P＜0.01，P＜0.05），抑制劑組、透骨消痛膠囊組均低于模型組（P＜0.01，P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 miRNAs表達(dá)比較（2-△△CT）（±s）Table 4 Comparison of miRNAs expression（2-△△CT）（±s）

表4 miRNAs表達(dá)比較（2-△△CT）（±s）Table 4 Comparison of miRNAs expression（2-△△CT）（±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。Note:Compared with the model group,1)P＜0.01,2)P＜0.05.

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4 討 論

OA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”“痿證”范疇，病位在肝腎，病在筋骨，以肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)致痿為本，以腠理空虛復(fù)感風(fēng)寒濕邪致痹為標(biāo)［13］。透骨消痛膠囊由巴戟天、白芍、川芎、腫節(jié)風(fēng)組成，方中巴戟天辛溫，補(bǔ)腎強(qiáng)筋，祛風(fēng)除濕以治本為君藥；白芍苦酸，養(yǎng)血柔肝止痛為臣藥；川芎辛溫，活血行氣，祛風(fēng)止痛，腫節(jié)風(fēng)祛風(fēng)通絡(luò)，活血止痛，二者均為佐使藥。四藥共奏補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、止痹痛之功效，長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床療效可靠。

Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路的一部分［14］。當(dāng)炎癥因素刺激細(xì)胞后，炎癥因子與細(xì)胞膜上的受體特異性結(jié)合，從而激活MAPK信號(hào)下游的Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路，即經(jīng)信號(hào)傳遞后，Ras由失活狀態(tài)轉(zhuǎn)為活化，并進(jìn)一步活化在胞膜上的Raf，Raf被激活后與信號(hào)通路中的“樞紐”MEK結(jié)合，從而激活MEK，活化的MEK則與ERK直接聯(lián)接，激活ERK，使其由胞漿進(jìn)入胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子，以此參與調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥等生物過(guò)程，引起OA軟骨退變等病理改變［15-16］。故Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路是治療OA的一個(gè)潛在途徑。LPS則可以通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活相關(guān)炎癥信號(hào)通路，刺激多個(gè)炎癥因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1等表達(dá)，多用于炎癥反應(yīng)的體外研究。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，10 ng／mL LPS干預(yù)8 h可明顯刺激TNFα、IL-1β的表達(dá)，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)［12］。故本研究中選擇LPS作為誘導(dǎo)劑，建立大鼠軟骨細(xì)胞體外炎癥模型進(jìn)行研究。

MMPs是參與細(xì)胞外基質(zhì)變性降解和OA發(fā)病的主要蛋白酶。MMPs家族成員眾多，不同的MMPs可作用于不同的軟骨基質(zhì)導(dǎo)致其降解［17］。MMP-13是引起OA軟骨退變的眾多MMPs中最為關(guān)鍵的酶，在軟骨基質(zhì)的降解中起主導(dǎo)作用，在優(yōu)先消化Ⅱ型膠原的同時(shí)，還能夠降解蛋白多糖，加速破壞軟骨基質(zhì)。MMP-3在降解多種膠原和蛋白多糖的同時(shí)，激活其他的MMPs，介導(dǎo)結(jié)締組織的重塑。一般情況下MMPs的正常作用可以維持軟骨基質(zhì)的合成與降解平衡，而炎癥因子會(huì)導(dǎo)致MMPs過(guò)度表達(dá)，軟骨基質(zhì)降解過(guò)度，最終導(dǎo)致軟骨病變。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)LPS刺激后模型組中Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子及MMP-3、MMP-13表達(dá)均明顯增多，表明LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型成功建立。透骨消痛膠囊干預(yù) 后 則 明 顯 降 低Ras、Raf、MEK1／2、ERK1／2的 表達(dá)，其趨勢(shì)同抑制劑組一致，表明透骨消痛膠囊可調(diào)控Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)；同時(shí)透骨消痛膠囊干預(yù)后MMP-3、MMP-13的表達(dá)亦減少，表明透骨消痛膠囊可抑制炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)降解。

在OA中，miRNAs參與調(diào)控炎癥因子及MMPs的表達(dá)，對(duì)軟骨基質(zhì)的合成、降解有關(guān)鍵的調(diào)控作用［18］。在使用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞后，miR-27b的表達(dá)明顯降低，并促進(jìn)Col2a1、抑制MMP-13的表達(dá)，從而影響軟骨基質(zhì)的降解，且MMP-13是miR-27b的靶基因之一［7］。miR-34a則與炎癥因子介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)，在OA患者軟骨中的表達(dá)增多［8］。IL-1β作為誘導(dǎo)劑刺激軟骨細(xì)胞后，miR-34a表達(dá)明顯增高，并引起細(xì)胞死亡和衰老。miR-34a還可以降低Col2a1基因的表達(dá)，影響Ⅱ型膠原表達(dá)，破壞軟骨的合成［19］。miR-146a則刺激多種炎癥因子的表達(dá)，并受炎癥因子的影響。軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5經(jīng)LPS刺激后，炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)和產(chǎn)物增加，miR-146a表達(dá)亦明顯上升，并且過(guò)表達(dá)miR-146a后加重了LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷［9］。另有研究表明［20］，miR-146a通過(guò)靶向TNF受體相關(guān)因子6（Tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）和IL-1受體相關(guān)激酶1（interleukin receptor-1 associated kinase-1，IRAK1）作為促炎信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)器，參與到OA炎癥反應(yīng)中。

本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組中miR-27b表達(dá)明顯降低，miR-146a、miR-34a表達(dá)明顯升高，而透骨消痛膠囊干預(yù)后，miR-27b表達(dá)上升，miR-146a、miR-34a的表達(dá)下降，說(shuō)明透骨消痛膠囊可以調(diào)控上述miRNAs的表達(dá)，通過(guò)調(diào)控mRNA的起始調(diào)控因子，抑制OA炎癥反應(yīng)及軟骨基質(zhì)的降解。

綜上，透骨消痛膠囊通過(guò)調(diào)控Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號(hào)通路中關(guān)鍵調(diào)控因子及miR-27b、miR-146a、miR-34a的表達(dá)，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而抑制骨關(guān)節(jié)炎炎癥及軟骨基質(zhì)的降解，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。但由于OA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，且中藥成分復(fù)雜具有多靶點(diǎn)的特性，其機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究證實(shí)。